蛋白質(zhì)的泛素化修飾在真核生物中廣泛存在,參與細(xì)胞的多種調(diào)控過程,包括對非生物脅迫的適應(yīng)過程。UPL泛素連接酶(HECT ubiquitin-protein ligase,UPL)屬于泛素連接酶E3的一種,其蛋白結(jié)構(gòu)中包含HECT結(jié)構(gòu)域,在蛋白質(zhì)泛素化中起重要作用。UPL家族在木本植物研究較少,特別是果樹基因組中UPL編碼基因、蛋白結(jié)構(gòu)特征及功能的研究尚未見報(bào)道。本研究對蘋果UPL基因家族進(jìn)行了基因組范圍內(nèi)的鑒定和綜合分析,篩選出了蘋果UPL基因家族的全部成員,并對其序列特征、功能結(jié)構(gòu)域、脅迫響應(yīng)等進(jìn)行了分析;利用高通量測序技術(shù),研究了新疆野蘋果在干旱、鹽和低溫等脅迫下轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組變化規(guī)律,本研究擬從分子水平上揭示蘋果的逆境調(diào)控機(jī)制,對于探究逆境條件下的生命活動(dòng)規(guī)律、植物野生資源保護(hù)、抗逆育種具有重要意義。本研究的主要結(jié)果如下:(1)蘋果基因組中鑒定得到13個(gè)UPL編碼基因。采用BLAST和隱馬爾可夫模型兩種方法在蘋果基因組中搜索,最終鑒定得到13條UPL編碼基因,分布在蘋果基因組的10條染色體上,分別命名為Md UPL1-13。MdUPL蛋白分子大小差別大,長度在411-4239氨基酸殘基之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),有7個(gè)MdUPL蛋白定位在細(xì)胞核上,4個(gè)定位在質(zhì)膜上,還有2個(gè)分別定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體上,暗示不同的UPL蛋白可能在不同的細(xì)胞器中行使不同的功能。(2)MdUPL蛋白家族含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。序列分析表明,MdUPL蛋白的HECT結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)特征Motif序列且均形成α螺旋,3段α螺旋在空間上配置形成特定的HECT空間結(jié)構(gòu),一個(gè)可與泛素分子結(jié)合的保守半胱氨酸殘基處于此特定空間結(jié)構(gòu)的中心,3個(gè)特征Motif及其形成的空間結(jié)構(gòu)可能與UPL蛋白通過HECT結(jié)構(gòu)域與泛素分子結(jié)合并催化底物蛋白泛素化直接相關(guān)。在13個(gè)MdUPL中,有5個(gè)MdUPL蛋白只含有HECT結(jié)構(gòu)域,從另外8個(gè)Md UPL蛋白中,還檢測到額外5種功能結(jié)構(gòu)域,其中UIM和UBA兩種結(jié)構(gòu)域成對出現(xiàn)在4個(gè)Md UPL中,ARM結(jié)構(gòu)域存在于3個(gè)Md UPL中,UBQ結(jié)構(gòu)域存在于MdUPL3和MdUPL7中,F-box結(jié)構(gòu)域只存在于MdUPL7中。(3)蘋果UPL基因響應(yīng)非生物脅迫。13個(gè)MdUPL基因的啟動(dòng)子中均含有多個(gè)與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件,說明MdUPL基因可能通過順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用參與植物的脅迫應(yīng)答;qRT-PCR檢測表明,幾乎所有MdUPL基因的表達(dá)都受到干旱、鹽或低溫脅迫不同程度的誘導(dǎo),特別是MdUPL7和MdUPL9在低溫脅迫下表達(dá)上調(diào)都超過15倍并且在干旱脅迫下也呈現(xiàn)顯著的表達(dá)上調(diào),說明這兩個(gè)基因與植物對低溫和干旱條件的適應(yīng)有關(guān)。MdUPL4和MdUPL6與在擬南芥中的同源基因AtUPL3在干旱脅迫下的表達(dá)變化趨勢相反,蘋果和擬南芥UPL基因家族的表達(dá)模式可能存在差異。(4)利用RNA-Seq技術(shù)分析了非生物脅迫對新疆野蘋果轉(zhuǎn)錄組的影響。干旱脅迫處理幼苗,篩選出共6625個(gè)差異表達(dá)基因(2227個(gè)上調(diào),4398個(gè)下調(diào));鹽脅迫共7605個(gè)(2033個(gè)上調(diào),5572個(gè)下調(diào));低溫脅迫共14963個(gè)(6729個(gè)上調(diào),8234個(gè)下調(diào))。每種脅迫下的差異表達(dá)基因中,功能未知基因數(shù)都占20%以上。2639個(gè)基因在三種脅迫條件下其表達(dá)均發(fā)生上調(diào)或下調(diào)。利用qRT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,隨機(jī)選取的13個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致,證明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。三種脅迫條件下大部分差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞代謝、次生代謝產(chǎn)物合成、植物-病原菌互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝通路。三種脅迫條件下表達(dá)量差異大的前10位的基因主要是功能未知基因,說明新疆野蘋果中存在許多逆境應(yīng)答相關(guān)的新基因。(5)利用iTRAQ技術(shù)分析了非生物脅迫對新疆野蘋果蛋白質(zhì)組的影響。本研究共鑒定出4155個(gè)蛋白,干旱脅迫下差異表達(dá)蛋白共634個(gè)(373個(gè)上調(diào),261個(gè)下調(diào));鹽脅迫下共471個(gè)(239個(gè)上調(diào),232個(gè)下調(diào));低溫脅迫下共803個(gè)(466個(gè)上調(diào),337個(gè)下調(diào))。近百個(gè)蛋白在三種脅迫條件下表達(dá)均發(fā)生明顯上調(diào)或下調(diào),三種脅迫的差異蛋白大多屬于氧化還原酶,有相當(dāng)一部分是葉綠體基質(zhì)、質(zhì)體和類囊體蛋白,這些蛋白主要參與氧化還原調(diào)控和脅迫響應(yīng)等,與細(xì)胞代謝、氧化磷酸化途徑和光合作用等代謝通路有關(guān)。(6)非生物脅迫轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),不同脅迫下,mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均發(fā)生變化的基因中,約有一半左右的基因表達(dá)的變化趨勢在m RNA水平和蛋白水平一致。其中,干旱脅迫下mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均發(fā)生變化的蛋白有52個(gè)(23個(gè)趨勢相同);鹽脅迫有47個(gè)(29個(gè)趨勢相同);低溫脅迫有141個(gè)(71個(gè)趨勢相同)。關(guān)聯(lián)到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中,三種脅迫下變化趨勢相同的蛋白質(zhì)主要參與能量代謝和翻譯后修飾。有相當(dāng)數(shù)量的基因,脅迫后蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)間相關(guān)性不高,有些數(shù)據(jù)是否可靠,還需要用不同的方法進(jìn)一步確定,才能更全面更清楚的了解植物體的生理調(diào)控機(jī)制。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：Q943.2;S661.1
【部分圖文】：

3個(gè)MdUPL基因染色體定位圖

44圖 3-2 MdUPL 的 HECT 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對保守的半胱氨酸位點(diǎn)由紅色方框標(biāo)出。Fig. 3-2 Multiple alignments of the HECT domains of all MdUPLs from appleConserved amino acid of cysteine is enclosed with a red rectangle.

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文.1.2 蘋果 UPL 基因的多序列比對和基因結(jié)構(gòu)分析多序列比對結(jié)果顯示 13 個(gè) MdUPL 基因均含有一個(gè)保守的 HECT 結(jié)構(gòu)域，并且一個(gè)位置含有一個(gè)與泛素蛋白結(jié)合的半胱氨酸殘基（圖 3-2）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所 MdUPL 基因分為 4 個(gè)不同的群組，分別命名為 H-1， H-2， H-3 和 H-4（圖 3-3為進(jìn)一步了解 MdUPL 基因的結(jié)構(gòu)演變，我們分析了 MdUPL 基因的結(jié)構(gòu)（圖 3-4因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示 MdUPL 基因內(nèi)含子的數(shù)量從 3 個(gè)至 28 個(gè)不等，其中大部dUPL 基因含有超過 10 個(gè)內(nèi)含子。其中，H-1 組中 MdUPL 基因外顯子的平均長度他 3 組中的更長。同一組內(nèi) MdUPL 基因的外顯子分布特征相似，而組間的差異較大
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本文編號(hào)：2866905