‘瑪瑙紅’櫻桃(Prunus pseudoceresus‘Manaohong’)是貴州省選育出的耐貯運(yùn)優(yōu)良新品種,但該品種存在嚴(yán)重的胚敗育問題,極大地制約了雜種苗的獲得。如何獲得‘瑪瑙紅’櫻桃實(shí)生苗,已成為雜交育種亟待解決的瓶頸問題,因此建立‘瑪瑙紅’櫻桃胚搶救體系,對提供雜交育種效率有重要意義;長期以來,櫻桃、桃等核果類果樹一直被公認(rèn)為是較難進(jìn)行離體再生的一類樹種,基因工程也明顯落后于其它果樹。鑒于上述背景,本文以‘瑪瑙紅’櫻桃幼胚為供試材料,對不同發(fā)育時(shí)期的種胚進(jìn)行解剖學(xué)觀察和萌發(fā)試驗(yàn),確定種胚敗育的時(shí)期和最佳胚搶救時(shí)間,通過設(shè)置植物生長調(diào)節(jié)劑配比研究其對種胚萌發(fā)及幼苗增殖的影響,建立高效的胚搶救技術(shù)體系;利用幼胚誘導(dǎo)愈傷組織,并采用愈傷進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,建立‘瑪瑙紅’櫻桃愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下:1.‘瑪瑙紅’櫻桃幼胚大規(guī)模敗育發(fā)生在盛花期后第30天,最佳胚搶救時(shí)間為盛花期后第25天。2.建立了‘瑪瑙紅’櫻桃高效穩(wěn)定的胚搶救技術(shù)體系。選取盛花后第25天幼胚,接種在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上,培養(yǎng)30天,萌發(fā)率達(dá)70%;10天后,轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L IBA+0.5 mg/L GA_3+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng),培養(yǎng)30天后,組培苗可達(dá)3-4 cm高,增殖系數(shù)為5.45。3-4 cm高的多叢芽轉(zhuǎn)接到MS+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng),30天后,不定根數(shù)目平均可以達(dá)到5根,平均根長6.46 cm,選取生長較好的組培苗經(jīng)馴化、練苗后移栽至無菌營養(yǎng)土中,成活率達(dá)90%。3.通過植物生長調(diào)節(jié)劑組合正交試驗(yàn),確定了‘瑪瑙紅’櫻桃愈傷誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基:MS+1.5 mg/L TDZ+1.5 mg/L IBA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。在后期增殖培養(yǎng)中,先暗培25天再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)利于愈傷增殖。4.以愈傷為轉(zhuǎn)化受體,Kan的篩選強(qiáng)度為80 mg/L,Tim的抑菌濃度為150mg/L。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的櫻桃愈傷遺傳轉(zhuǎn)化體系為:農(nóng)桿菌的侵染時(shí)間20 min、菌液OD_(600)值為0.8,共培養(yǎng)基中AS濃度為20 mg/L時(shí),愈傷在含80 mg/L Kan、150 mg/L Tim的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng),可得到最多的具有Kan抗性的愈傷,經(jīng)GUS化學(xué)染色和PCR檢測后,統(tǒng)計(jì)得轉(zhuǎn)化率最高為1.33%。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S662.5
【部分圖文】：

成活率=成活株數(shù)/移栽總株數(shù)×100%果與分析胚發(fā)育觀測表明，櫻桃胚的敗育率隨發(fā)育時(shí)間的延長呈現(xiàn)增長趨勢（圖5天敗育率增長較緩慢，在25-30天敗育率從37%急劇增加至變化不大。因此，確定‘瑪瑙紅’櫻桃大規(guī)模的胚敗育時(shí)間實(shí)種胚解剖觀察分析表明，盛花期后前 20 天幼胚未敗育的種較軟，種胚飽滿且呈透明水乳狀(圖 2a)，25 天后敗育的果實(shí)胚皺縮并與種殼分離(圖 2b)；對成熟種胚觀察發(fā)現(xiàn)，正常種圓潤，敗育型種胚則由于發(fā)育受阻，個(gè)體干癟皺縮(圖 2c)。

圖 2 ‘瑪瑙紅’櫻桃種胚的解剖觀察a：發(fā)育 20d 未敗育；b：發(fā)育 25d 敗育；c：成熟種胚Fig. 2 Anatomic observation in embryo development of cherry 'Manaohong'a: unabortion (20 DAB); b: abortion (25 DAB); c: mature embryos2.2 最佳胚搶救時(shí)間取樣時(shí)期是影響胚搶救最重要的因素（Li et al.，2014），對盛花期后不同發(fā)育時(shí)間的胚進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，由表 3 可知，胚發(fā)育時(shí)間在 25 天前，正常胚發(fā)育指數(shù)(PF 值)小于 0.30，胚萌發(fā)率為 0，此時(shí)種胚 PF 值尚小，對胚進(jìn)行搶救的難度大。隨胚發(fā)育時(shí)間增長 PF 值增大，不同發(fā)育時(shí)間胚萌發(fā)率有所差異，第 25 天萌發(fā)率最大，達(dá) 34%，顯著高于其他發(fā)育時(shí)期的萌發(fā)率。第 30 天、35 天兩個(gè)時(shí)期的發(fā)育正常胚的 PF 值雖大于 0.5，但由于其敗育率較高，導(dǎo)致萌發(fā)率很低。因此，選擇發(fā)育時(shí)期為 25 天的‘瑪瑙紅’櫻桃幼胚胚搶救的成功率較高。表 7 不同發(fā)育時(shí)期的‘瑪瑙紅’櫻桃種胚萌發(fā)情況

貴州大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文長調(diào)節(jié)劑對幼胚萌發(fā)及生長的影響適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑可促進(jìn)胚胎的分化與發(fā)育（邱仲錦等，S 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的褐化率低，本研究探究不同濃度配比的生長調(diào)發(fā)及生長的影響。由圖 3 可看出，不同處理間的幼胚萌發(fā)存在理萌發(fā)率最高為 70%，顯著高于其他處理，其次為第 7 處理，瑙紅’櫻桃最佳幼胚培養(yǎng)激素組合為處理 16：MS + 0.5 mg/L T + 1.0 mg/L IBA。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2864260