番茄(Solanum lycopersicum L.)是深受人們喜愛的一種世界性蔬菜,具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。我國是目前世界上番茄產(chǎn)量最大的國家,因此,實現(xiàn)番茄的優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)至關(guān)重要。在實際生產(chǎn)中,各種非生物脅迫嚴重影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量,尤其是鹽脅迫。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的一類轉(zhuǎn)錄因子,研究表明,其時空表達存在特異性,廣泛參與調(diào)節(jié)植物的眾多生長發(fā)育進程和抗逆性。本研究克隆了番茄中一個響應(yīng)非生物脅迫的R2R3MYB基因SlMYB102,并對其進行功能驗證,具體結(jié)果如下:生物信息學分析表明,SlMYB102編碼362個氨基酸殘基;預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為41.522kD;等電點為5.60;疏水性平均值為-0.746,表明S1MYB102屬于親水性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)為41.10,表明S1MYB102蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白包含16.9%的a螺旋,0.6%的β折疊,82.6%的無規(guī)則卷曲;定位于細胞核中;具有轉(zhuǎn)錄激活活性。利用實時熒光定量PCR檢測了SlMYB102基因在根、莖、葉、花、果中的表達量,結(jié)果顯示該基因在檢測的各組織中都有表達,但在莖、葉、花中表達量較高,表明SlMKB102可能在莖、葉、花中起作用。為了驗證S1MYB102的功能,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的SlMYB102基因的過表達載體轉(zhuǎn)入矮生番茄Micro-Tom中,通過PCR驗證得到3個轉(zhuǎn)基因株系。利用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因株系的表達量,挑選出過表達倍數(shù)顯著的2個株系,命名為OE-1和OE-2,用以進行后續(xù)實驗。種子萌發(fā)速率試驗結(jié)果顯示,OE株系種子的萌發(fā)顯著快于WT,表明SlMYY102參與調(diào)控種子的萌發(fā)。測量并統(tǒng)計WT和OE株系在幼苗期及出現(xiàn)第一朵花序時期的株高,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OE植株的高度顯著低于WT,說明過表達SlMYY102基因影響番茄株商。為了驗證SlMYY102在鹽脅迫抗性中的作用,首先檢測了 NaCl脅迫處理不同時間WT和OE植株中SlMYB102以及鹽脅迫響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NaCl脅迫處理24h后,OE株系中所有被檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平均高于WT,進一步證明SlMYB102參與了鹽脅迫響應(yīng)。與未處理的對照株系的株高相比,NaCl脅迫處理下,WT和OE株系在幼苗時期植株高度均降低,但是比較OE與WT植株高度未見顯著性差異,說明過表達SlMYB102可以減少NaCl脅迫對番茄幼苗生長的影響。鹽處理10天后檢測WT和OE植株中脯氨酸和抗氧化酶活性,發(fā)現(xiàn)OE植株中脯氨酸含量以及POD、CAT、SOD酶活性均高于WT,說明過表達SlMKB102能夠在一定程度上提高番茄的耐鹽性。本研究結(jié)果表明,過表達番茄R2R3MYB基因SlMYB102能夠提高植株對于NaCl脅迫的抗性,為番茄耐鹽品種的培育提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S641.2
【文章目錄】：
縮略詞對照表
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 研究目的和意義
    1.2 國內(nèi)外研究進展
        1.2.1 鹽脅迫響應(yīng)機制研究進展
        1.2.2 植物耐鹽性研究進展
        1.2.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子研究進展
    1.3 基因功能研究方法——反向遺傳學
    1.4 主要實驗內(nèi)容及技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 試劑及設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基的配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 SlMYB102基因的生物信息學分析
        2.2.2 SlMYB102基因的組織表達特異性檢測
        2.2.3 SlMYB102過表達載體的構(gòu)建
        2.2.4 SlMYB102基因的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因驗證
        2.2.5 NaCl脅迫對野生型番茄和轉(zhuǎn)基因番茄的生理特性的影響
        2.2.6 SlMYB102酵母雙雜交自激活驗證
3 結(jié)果與分析
    3.1 SlMYB102基因的克隆
    3.2 SlMYB102基因的生物信息學分析
        3.2.1 SlMYB102蛋白的一級結(jié)構(gòu)
        3.2.2 SlMYB102蛋白的二級結(jié)構(gòu)
        3.2.3 SlMYB102蛋白的三級結(jié)構(gòu)
        3.2.4 SlMYB102蛋白與其他R2R3MYB蛋白的進化關(guān)系分析
        3.2.5 SlMYB102蛋白的亞細胞定位
        3.2.6 SlMYB102基因組織表達分析
    3.3 SlMYB102基因過表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
        3.3.1 SlMYB102基因過表達載體的構(gòu)建
        3.3.2 SlMYB102基因的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.3.3 SlMYB102過表達植株轉(zhuǎn)基因驗證
        3.3.4 SlMYB102過表達株系表達量檢測
    3.4 SlMYB102過表達株系表型初步觀察
        3.4.1 過表達SlMYB102提高了種子萌發(fā)速率
        3.4.2 過表達SlMYB102影響植株高度
        3.4.3 SlMYB102過表達株系的花、果外觀與WT相比無顯著變化
    3.5 過表達SlMYB102增強了番茄植株的耐鹽性
        3.5.1 NaCl脅迫下SlMYB102及鹽脅迫響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達量分析
        3.5.2 轉(zhuǎn)基因株系不同組織中SlMYB102表達量檢測
        3.5.3 NaCl脅迫對WT和過表達株系幼苗的影響
        3.5.4 NaCl對WT及轉(zhuǎn)基因植株生理特性的影響
    3.6 SlMYB102具有轉(zhuǎn)錄激活活性
4 討論
    4.1 SlMYB102定位于細胞核中是其功能實現(xiàn)的基礎(chǔ)
    4.2 SlMYB102的組織表達特性分析
    4.3 野生型與轉(zhuǎn)基因番茄株高差異分析
    4.4 SlMYB102可能參與了番茄中多個鹽脅迫響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
5 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝

【參考文獻】

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本文編號：2859029