蘿卜(Raphanus sativus L.,2n=2x=18),十字花科蘿卜屬一、二年生根菜類蔬菜,是廣泛種植于我國的重要經(jīng)濟(jì)作物。蘿卜在生長過程中易受各種病原菌侵襲而誘發(fā)病害,導(dǎo)致蘿卜品質(zhì)差,產(chǎn)量下降,進(jìn)而造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此,選育蘿卜抗病新品種成為控制病害發(fā)生的有效途徑。近年來,隨著全基因組測序工作的完善,利用全基因組序列進(jìn)行抗病基因分離已成為抗性研究熱點。研究表明,含有核苷酸結(jié)合位點(NBS)結(jié)構(gòu)域的抗病基因為抗病基因家族中數(shù)量最多的一類,在抵御病原菌侵染方面起重要作用。然而,蘿卜全基因組NBS-LRR類抗病基因的分離鑒定工作尚未見報道,而且蘿卜NBS抗病基因同源序列分離工作仍有待進(jìn)一步深入。本研究鑒定分析了蘿卜全基因組中NBS-LRR類抗病候選基因序列,并對部分候選基因進(jìn)行分離克隆。另外,利用NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計簡并引物,分離蘿卜抗病基因同源序列,同時分析了部分克隆基因和同源序列的表達(dá),本文主要研究結(jié)果如下:1、蘿卜全基因組中共鑒定到188個含NBS結(jié)構(gòu)域的抗病候選基因,根據(jù)C端是否含TIR結(jié)構(gòu),可將188個基因分成128個TIR-NBS-LRR和60個non-TIR-NBS-LRR(CC-NBS-LRR)兩大類。其中,74個RsNBS基因(39.36%)定位于蘿卜連鎖群R1-R9上。RsNBS基因在連鎖群中分布相對分散,數(shù)量也各有不同。本研究中部分基因以基因簇形式存在,共鑒定到12個基因簇。R7上基因數(shù)最多(13個RsNBS基因),R6含有的基因簇最多(3個基因簇),R8所含基因簇中基因數(shù)最多(6個RsNBS基因)。2、進(jìn)化關(guān)系研究表明,蘿卜NBS-LRR基因與擬南芥NBS類抗病基因具有較近的親緣關(guān)系�；蚝突蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,188個蘿卜抗病候選基因中均包含NBS保守結(jié)構(gòu)域,并且包含保守基序(P-loop、RNBS-A、Kinase-2、RNBS-B和GLPL)和保守結(jié)構(gòu)域(TIR、CC和LRR等)�；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),RsNBS基因含有平均外顯子數(shù)為4.87。TNL類和CNL類RsNBS基因平均外顯子個數(shù)分別為5.59和3.33個,而部分CNL類RsNBS基因(28.3%)由單個外顯子編碼而成。除RsNBS164外,其余TNL類RsNBS基因均由2個以上外顯子構(gòu)成。3、利用簡并引物進(jìn)行PCR擴增,從蘿卜中分離到50條具有完整開放閱讀框的抗病基因同源序列(RGAs),將其命名為RsRGA01-RSRGA50。聚類進(jìn)化分析表明,50條同源序列分為TNL和CNL兩類,分別含有14條和36條抗病基因同源序列,又可細(xì)分為 RsRGAⅠ、RsRGA Ⅱ、RsRGA Ⅲ、RsRGA Ⅳ、RsRGA Ⅴ 和 RsRGA Ⅵ。序列比對和基序分析表明所有序列均含有P-1oop、RNBS-B和kinase-2基序。其中,RsRGA31與擬南芥RPM1的相似性達(dá)89.77%,推測其可能與RPM1同源,且具有相似功能。對本研究中部分RsNBS基因進(jìn)行DNA序列克隆,驗證了數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)確性。qRT-PCR分析結(jié)果表明,3個RsRGAs序列(RsRGA08、RsRGA34、RsRGA44)和4個 RsNBS基(RsNBS021、RsNBS044、RsNBS062、RsNBS164)在不同蘿卜品種不同處理下呈現(xiàn)出差異表達(dá)模式,推測這些序列和基因在蘿卜抗病防御信號途徑中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S436.31
【部分圖文】：

（Ｍｅｙｅｒ?ｅｔａｌ．，?２００３；?Ｍｅｙｅｒ?ｅｔａｌ．，?１９９９：?Ｐａｎ?ｅｔａｌ．，２０００）。ＲＮＢＳ－Ｄ?并不是總是存在于??ＴＩＲ和ＣＣ結(jié)構(gòu)域中，這可能是為了促使其與ＡＲＣ２發(fā)生相互作用而與Ｎ端所含結(jié)構(gòu)??域共同進(jìn)化的結(jié)果（Ｄｅｓｌａｎｄｅｓ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１２）。圖１－１描述ｒ幾種常見Ｒ蛋白的多種基序??及其結(jié)構(gòu)組成。??Ａ??Ｔ１Ｒ?ＮＢ?ＡＲＣ１?ＡＲＣ２?ＬＲＲ??ＴＳＲＩ?ｒ（Ｒ２ＴＩＲＪ?Ｐ－ｉｏｏｐＫｔｎａｓｅ－２?ＫＮ？Ｓ－？?ＧＬＰＬ?ＭＨＤ??ｉ?Ｉ?ｉｉｓ??ＣＮＬ?ｍ????ＥＤＶＩＤ?ＲＮＢＳ－Ｄ??ＣＣ??Ｂ??ＳＰ?ＬＲＲ?ＴＭ?Ｋｉｎａｓｅ??ＲＬＫ?—尸廠—；??ＲＬＰ?｜?—廠－??圖１－１四種主要植物Ｒ蛋白常見結(jié)構(gòu)示意圖（Ｓｅｋｈｗａｌｅｔａｌ．

行進(jìn)化分析，并使用ＣＬＵＳＴＡＬＷ對ＮＢＳ結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對。為了深入研究蘿卜中??ＮＢＳ－ＬＲＲ抗病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，先使用Ｎ－Ｊ法對１３７個擬南芥ＮＢＳ基因進(jìn)行系??統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，驗證擬南芥中ＮＢＳ蛋白的分類（圖２－１Ａ）。根據(jù)擬南芥ＮＢＳ蛋白家??族的分類，可將蘿卜中ＮＢＳ蛋白分為２大亞群——ＴＮＬ類（１２８）和ＣＮＬ類（６０）。??胃謂｜?■羣??圖２－１蘿卜與擬南芥ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白進(jìn)化分析??（Ａ）擬南芥ＮＢＳ蛋白進(jìn)化樹；（Ｂ）?ＲｓＮＢＳ蛋白和ＡｔＮＢＳ蛋白進(jìn)化樹??Ｆｉｇ．?２－１?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ａｎｄ?ＡｔＮＢＳ?Ｐｒｏｔｅｉｎｓ??（Ａ）?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＡｔＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ；?（Ｂ）?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ａｎｄ?ＡｔＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??分別對蘿卜中ＴＮＬ類和ＣＮＬ類ＮＢＳ蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖２－２，圖２－３）。??根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，我們發(fā)現(xiàn)ＴＮＬ類抗病基因的數(shù)量與ＣＮＬ類抗病基因的數(shù)??量呈現(xiàn)２：１的比例，這與在擬南芥中的發(fā)現(xiàn)類似（Ｍｅｙｅｒｓｅｔａｌ．，２００３）。另外，雙子葉??和單子葉植物中ＴＮＬ和ＣＮＬ兩個亞類的抗病基因數(shù)目不同。蘿卜中ＴＮＬ類抗病基??因占主要優(yōu)勢，１２８個ＴＮＬ類ＮＢＳ基因，被分成９個亞群（圖２－３），占蘿卜ＮＢＳ基??因總數(shù)的?６８％，分別是?ＴＮＬ－Ａ（９）、ＴＮＬ－Ｂ（１７）、ＴＮＬ－Ｃ（２）、ＴＮＬ－Ｄ（１２）、ＴＮＬ－Ｅ（７）、??ＴＮＬ－Ｆ（７）、ＴＮＬ－Ｇ（３７）、ＴＮＬ－Ｈ（２３）、ＴＮ（１４）。其中?ＴＮＬ－Ｇ?類基因數(shù)最多

??圖２－４蘿卜ＮＢＳ蛋白和基因結(jié)構(gòu)分析。（Ａ）?１８８個ＲｓＮＢＳ蛋白進(jìn)化分析；（Ｂ）?１８８個ＲｓＮＢＳ基??因內(nèi)含子－外顯子結(jié)構(gòu)分析；（Ｃ）?１８８個ＲｓＮＢＳ蛋白保守基序分析??Ｆｉｇ．?２－４?Ｔｈｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ａｎｄ?ｇｅｎｅｓ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．?（Ａ）?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ；??（Ｂ）?Ｉｎｔｒｏｎ－ｅｘｏｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ｇｅｎｅｓ；?（Ｃ）?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｍｏｔｉｆ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ??ｐｒｏｔｅｉｎｓ??由于ＲｓＮＢＳ０８５蛋白序列在靠近終止密碼子一端存在３９個未知氨基酸，故不對??其進(jìn)行蛋白分析。蘿卜ＮＢＳ蛋白的相對分子質(zhì)量（ＭＷ）在３．４到３１１．５ＫＤａ之間，??理論等電點（ｐｉ）在４．９７到９．５７范圍內(nèi)。１３４個ＲｓＮＢＳ蛋白的理論等電點小于７，說??明這些蛋白為酸性（圖２－５Ａ）。ＲｓＮＢＳ蛋白的ＭＷ在５０－２００ＫＤａ范圍內(nèi)較集中，擁??有１７１個成員，占蛋白總數(shù)的９０．９％?（圖２－４Ａ）。脂肪系數(shù)分析表明，大多數(shù)ＲｓＮＢＳ??蛋白含有大量脂肪氨基酸，此外，所有ＲｓＮＢＳ蛋白均被預(yù)測為親水性蛋白（圖２－５Ｂ）。??不穩(wěn)定系數(shù)在一定程度上能反應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，ＲｓＮＢＳ蛋白平均不穩(wěn)定系數(shù)為??４４．６９?（＞４０．０）
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 游啟孫;莫廷輝;曾麗星;張影波;解輝;歐陽超;;巴西橡膠NBS-LRR抗病基因類似物多樣性分析[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報;2013年03期

2 羅靈杰;周以飛;柯蘭蘭;潘大仁;;綠豆NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆與分析[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2014年01期

3 屈滿義;查向東;王鈺;楊金環(huán);蔣琳;阮龍;;甘薯NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆、分析及數(shù)目研究[J];熱帶作物學(xué)報;2008年05期

4 張穎;李峰;劉崇懷;樊秀彩;孫海生;姜建福;張國海;;中國野生刺葡萄抗白腐病NBS-LRR類抗病基因同源序列的分離與鑒定[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年04期

5 闕友雄;許莉萍;林劍偉;陳如凱;;甘蔗NBS-LRR類抗病基因同源序列的分離與鑒定[J];作物學(xué)報;2009年04期

6 林巧玲;曾會才;;甘薯中NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆及序列分析[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報;2007年02期

7 顧連峰;郭榮發(fā);;水稻NBS-LRR基因選擇性剪接的全基因組檢測及分析(英文)[J];遺傳學(xué)報;2007年03期

8 王海燕;楊文香;劉大群;;小麥NBS-LRR類抗病基因同源序列的分離與鑒定[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年08期

9 陳玲;張顥;邱顯欽;晏慧君;王其剛;蹇洪英;唐開學(xué);;云南懸鉤子薔薇NBS-LRR類抗病基因同源克隆與分析[J];植物分類與資源學(xué)報;2012年01期

10 鄧梅;何坤;魏育明;陳國躍;;黑麥屬NBS-LRR類抗病基因同源序列的分離與鑒定[J];四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2011年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 黃萱;小麥NBS-LRR抗性基因克隆以及基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦蕎遺傳轉(zhuǎn)化[D];西北大學(xué);2006年

2 羅莎;禾本科中NBS-LRR類抗病基因的進(jìn)化研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 劉文;華南普通野生稻遺傳多樣性研究及NBS-LRR抗性基因發(fā)掘[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

4 張雨;植物NBS-LRR類抗病基因及小分子RNA的比較基因組學(xué)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 奧云朝倫;MicroRNA調(diào)控下的RNAi途徑關(guān)鍵基因及NBS-LRR類抗病基因在SMV侵染大豆中的作用研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年

6 李楠洋;棉花抗黃萎病基因篩選及NBS-LRR類抗病基因GbaNA1功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

7 劉燕;水稻稻瘟病廣譜和持久抗性基因的發(fā)現(xiàn)與定位及其抗病機理的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

8 王德富;小麥候選抗病基因TaRGA對白粉病的抗性與Hpa1_(10-42)轉(zhuǎn)基因?qū)Π追鄄『统嗝共〉目剐訹D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

9 呂啟明;水稻抗稻瘟病基因Pid3的抗性同源基因發(fā)掘與人工進(jìn)化研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 龐志乾;水稻Pid3抗病基因介導(dǎo)稻瘟病免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張維;蘿卜全基因組NBS-LRR抗病基因鑒定與NBS抗病基因同源序列克隆[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 史金艷;全基因組分析陸地棉NBS-LRR類抗病基因并研究其對黃萎病的抗性作用[D];山西師范大學(xué);2018年

3 羅靈杰;綠豆NBS-LRR類抗病基因克隆及其表達(dá)研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2014年

4 趙敬;辣椒內(nèi)參基因的篩選及NBS-LRR類抗病基因同源序列的鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 盧珊;擬南芥NBS-LRR基因家族的生物信息學(xué)分析[D];吉林大學(xué);2008年

6 林巧玲;甘薯NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆與分析[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 孔巍;海島棉NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆與定位[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2003年

8 楊慧;光敏色素B調(diào)控的一個水稻NBS-LRR基因的表達(dá)和功能初探[D];山東理工大學(xué);2011年

9 王春瑋;花生NBS-LRR家族基因的克隆和功能分析[D];山東大學(xué);2013年

10 陳郁;菰（Zizania latifolia Griseb.）中NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆及其在漸滲雜交系中的遺傳和表觀遺傳變異分析[D];東北師范大學(xué);2004年

本文編號：2845282