發(fā)布時間：2020-10-17 19:26

　　 白菜種皮顏色是十字花科蕓薹屬作物一個重要的園藝性狀,根據(jù)種皮顏色的不同可以將蕓薹屬作物的種子分為黃色種子和棕色種子兩大類。相比于棕籽,黃籽生產(chǎn)的油及膳食質(zhì)量更高,不僅如此,黃籽含油量更高,生產(chǎn)的油更清亮,粗纖維含量更低,蛋白質(zhì)含量更高,并且菜籽殘渣對喂養(yǎng)動物具有更好的飼養(yǎng)價值。從蕓薹屬作物起源來講,白菜是甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜的原始親本之一,是我國主要的蔬菜作物和油料作物,因此對于白菜黃籽的研究和黃籽油菜品種的選育具有重大的意義。本研究選取大白菜棕籽純系‘92S105’、黃籽純系‘91-125’及其雜交獲得的F_1代、F_1代單株自交獲得F_2代分離群體以及F_3代棕籽純系B147和黃籽純系B80為研究材料,對種皮顏色基因進(jìn)行精細(xì)定位,鑒定了控制種皮顏色的候選基因,克隆并分析了候選基因序列差異及基因表達(dá)差異,同時選取合適發(fā)育時期的種子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和類黃酮成分分析,綜合分析了黃色種皮顏色形成的原因。取得了以下主要的結(jié)果:1.根據(jù)對棕籽純系‘92S105’和黃籽純系‘91-125’雜交獲得的F_2代分離群體單株種皮顏色調(diào)查分析,結(jié)果表明白菜種皮黃色性狀是由單基因控制,且黃籽性狀對棕籽性狀為隱性遺傳。2.使用BSA法結(jié)合SSR分子標(biāo)記對種皮顏色進(jìn)行基因定位,定位群體為1575個單株的F_2代分離群體,精細(xì)遺傳圖譜顯示距離種皮顏色基因Brsc-ye最近的兩個標(biāo)記為SSR449a和SSR317,距離Brsc-ye的遺傳距離分別為0.07 cM和0.06 cM,這兩個側(cè)翼標(biāo)記將Brsc-ye基因定位在40.2 kb的物理區(qū)間內(nèi)。通過對兩個親本材料DNA的重測序,分析比較其在40.2 kb物理區(qū)間內(nèi)的變異,確定控制種皮顏色的候選基因為BrTTG1;序列分析發(fā)現(xiàn)黃籽BrTTG1中有94bp的堿基缺失,導(dǎo)致黃籽BrTTG1的基因序列全長僅為300bp,預(yù)測的蛋白質(zhì)序列全長僅含有99個氨基酸,且不含有WD40結(jié)構(gòu);根據(jù)BrTTG1序列在棕籽和黃籽中的不同,開發(fā)出了一個與種皮顏色共分離的SSR標(biāo)記Brsc-yettg1,該標(biāo)記可用于種皮顏色的早期鑒定選擇。3.選取F_3代自交親和的棕籽純系B147和黃籽純系B80花期的不同組織(根、短縮莖、蓮座葉、葉脈、花莖、莖生葉、花和花蕾)和不同發(fā)育時期的種子(花期授粉后8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d、20 d、22 d、24 d、26 d、28 d、30 d、32 d和34 d)為研究材料,檢測了BrTTG1基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,在不同組織中,BrTTG1基因均有表達(dá),而且BrTTG1在棕籽材料各個組織中的表達(dá)均高于黃籽材料;在不同發(fā)育時期的種子中,BrTTG1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平整體呈現(xiàn)波浪形,且在B147中的轉(zhuǎn)錄水平始終高于在B80中的轉(zhuǎn)錄水平。4.以B147和B80不同發(fā)育時期的種子為試材,對其種皮原花青素進(jìn)行DMACA染色,發(fā)現(xiàn)在棕籽B147中,原花青素在發(fā)育第14 d的種子中開始積累,且積累量隨著種子的成熟越來越多,而黃籽B80所有時期的種子中幾乎無明顯的原花青素的積累。根據(jù)DMACA染色后種皮顏色的變化,我們選擇開花后第10 d、14 d和28 d的種子進(jìn)行組織切片TBO染色觀察,結(jié)果顯示在B147中,類黃酮類物質(zhì)從種臍處開始積累,并逐漸延伸到色素層和柵欄組織中,而在B80中,類黃酮類物質(zhì)主要在種臍處積累,色素層和柵欄組織中積累量很少。5.通過LC-MS/MS對B147和B80開花后第10 d、14 d、28 d和34 d種子中類黃酮類物質(zhì)成分進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)了31種類黃酮類物質(zhì)。其中10種物質(zhì)僅在B147種子中檢測到,包括表兒茶素及其衍生物、原花青素二聚體和一些槲皮素衍生物,其中表兒茶素及其衍生物和原花青素二聚體在B80種子中始終都沒有檢測到;在B147第14 d以后的種子中檢測到了原花青素,這與種皮DMACA染色結(jié)果一致,說明原花青素是棕色種皮顏色形成的主要物質(zhì);槲皮素、山萘酚及其衍生物在B147和B80種子中沒有明顯的含量差異,因此推測槲皮素和山萘酚及其衍生物在種皮顏色差異形成過程中作用并不顯著。6.對B147和B80開花后第10 d、14 d和28 d種子進(jìn)行了RNA-seq分析,結(jié)果顯示在黃籽B80種子中,類黃酮生物合成途徑中的早期生物合成基因均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá),而晚期生物合成基因幾乎不表達(dá)。參與原花青素生物調(diào)控的MYB-bHLH-WDR復(fù)合體中的4個轉(zhuǎn)錄因子(TT2、EGL3、TT8和MYB5)中TT2和EGL3在B147和B80相同時期的種子中轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化,而TT8和MYB5在B147和B80相同時期的種子中轉(zhuǎn)錄水平差異顯著,說明B80中TTG1的突變不僅影響了類黃酮生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平,還影響了TT8和MYB5轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平。綜合種皮顏色候選基因的鑒定、LC-MS/MS及RNA-seq分析結(jié)果,可以看出TTG1的突變是影響種皮顏色由棕色變?yōu)辄S色的根本原因。黃籽中TTG1的突變導(dǎo)致其蛋白序列中WD40結(jié)構(gòu)的缺失,因此不能形成MBW三元復(fù)合體,使類黃酮生物合成途徑紊亂,表現(xiàn)為中上游基因的轉(zhuǎn)錄水平降低、下游基因幾乎不轉(zhuǎn)錄,同時使TT8和MYB5轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平降低,導(dǎo)致無法合成原花青素的單體表兒茶素,最終形成黃籽。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S634
【部分圖文】：

圖 1-1 原花青素和花青素生物合成通路（引自 Xu et al. 2015）Fig. 1-1 Pathway of procyanidin and anthocyanin biosynthesis (cited from Xu et al. 2015)1.3.3 MBW 復(fù)合物調(diào)控類黃酮基因的研究進(jìn)展MBW 是由 MYB、bHLH 和 WD40 三類轉(zhuǎn)錄因子組成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，可以調(diào)控花青素和原花青素一系列結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。MYB 和 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子存在于所有真核生物中，是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一 (Heim et al. 2003; Toledo-Ortiz et al. 2003; Dubos et a2010; Feller et al. 2011)。TTG1 是一類 WDR（WD 重復(fù)）蛋白，其突變體在黃酮類化合物生物合成和各種表皮細(xì)胞的形成中表現(xiàn)出多樣性特征 (Li et al. 2014; Chen et a

圖 1-2 MBW 對種皮原花青素生物合成的調(diào)控，發(fā)育中的種子的示意圖參考 Debeaujon et al. (2013)原花青素主要積累在內(nèi)細(xì)胞層（內(nèi)胚層、系帶和珠孔處），基因和蛋白質(zhì)的名稱用大寫字母表示（斜體表示基因），相應(yīng)的突變體用小寫斜體表示�？s寫：DFR，二氫黃酮醇-4-還原酶；EGL3，glabra3增強子；LDOX，無色花青素雙加氧酶；ANR，花青素還原酶；GST，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；LBG，晚期生物合成基因；MATE，多藥和毒性外排物轉(zhuǎn)運體；MBW，MYB-bHLH-WDR；PA，原花青素，彎曲箭頭表明 MBW 復(fù)合物對 TT8 表達(dá)具有細(xì)胞特異性作用 (Xu et al. 2015)Fig. 1-2 MBW regulation of proanthocyanidin biosynthesis in the seed coat. The schematic representationof a developing seed is cited by Debeaujon et al. (2013)PA-accumulating cells are localized in the most inner cell layers of the integuments (i.e., E, endothelium; C,chalaza; and M, micropyle area). Names of genes and proteins are indicated in capital letters (with italicsfor genes), and corresponding mutants in lower-case italics.Abbreviations: DFR, dihydroflavonol -4-reductase; EGL3, enhancer of glabra3; LDOX, leucoanthocyanidin dioxygenase; ANR, anthocyanidinreductase; GST, glutathione-S-transferase; LBG, late biosynthetic gene; MATE, multidrug and toxic effluxtransporter; MBW, MYB-bHLH-WDR; PA, proanthocyanidin. Curved arrows indicate the cellspecificinduction of TT8 expression by MBW complexes (Xu et al. 2015)

20白菜種子黃色種皮形成的分子機理2.1 材料與方法2.1.1 試驗材料本研究的試驗材料黃籽純系材料‘91-125’（圖 2-1 a）和棕籽純系材料‘92S105’（圖2-1 b）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)張魯剛教授白菜課題組選育。利用‘92S105’和‘91-125’雜交獲得的 F1雜交種，F(xiàn)1單株自交獲得 F2代分離群體，F(xiàn)2群體分批于 2013 年和 2014 年種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)蔬菜試驗田，有效植株分別為 199 株和 1376 株。種子成熟時期，肉眼觀察種皮顏色，并統(tǒng)計棕籽與黃籽單株的數(shù)量。為了確定 F2群體中棕籽單株的基因型，所有棕籽單株自交獲得 F3家系，通過觀察 F3家系植株種皮顏色分離情況確定對應(yīng) F2單株種皮顏色的基因型，即 F3家系全部為棕籽
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本文編號：2845225