馬纓杜鵑(Rhododendrondelavayi Franch.)是杜胃鵑屬(Rhododendron)常綠杜鵑亞屬(Subgen.Hymenanthes)的多年生高山木本花卉,具有較高的觀賞和藥用價(jià)值,同時(shí)作為重要的原始育種親本,具有重要科學(xué)研究與開發(fā)利用價(jià)值。迄今,馬纓杜鵑的全基因組序列已經(jīng)發(fā)布,勢(shì)必助推杜鵑屬植物在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的快速發(fā)展。然而,有關(guān)基因表達(dá)內(nèi)參基因的篩選研究較少,有待進(jìn)一步充實(shí)完善。本研究以馬纓杜鵑為研究對(duì)象,選取了 11個(gè)在木本植物中的常用候選內(nèi)參基因(GAPDH、Actin、、EF1a、、Tubulina-5、、Ubiquitin、、UEP、、UEC11、UEC2、、TIP41-LIKE FAMILYPROTEIN、Tubulin beta、TATAbindingprotein),采用實(shí)時(shí)熒光定 PCR技術(shù)分析了這11個(gè)候選內(nèi)參基因在馬纓杜鵑成年及幼年植株的不同發(fā)育時(shí)期及受干旱脅迫條件下葉片樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性。綜合內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件qBASE和NormFinde的分析結(jié)果,為不同試驗(yàn)樣品集篩選最佳內(nèi)參基因或組合,研究結(jié)果如下:1.本研究選取設(shè)計(jì)的11個(gè)常用候選內(nèi)參基因的引物,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),均能在馬纓杜鵑基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段,且擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率(94%-106%)均滿足本研究中內(nèi)參基因篩選的要求。2.本研究通過qBASE與NormFinder兩種內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件綜合分析11個(gè)常用候選內(nèi)參基因在馬纓杜鵑成年植株(成熟葉、花芽、雌蕊、雄蕊及花瓣)與幼年植株樣品集中的表達(dá)穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)在成熟葉樣品集中,最適內(nèi)參基因組合為GAPDH+Actin;在花芽樣品集中,最適內(nèi)參基因組合為Tubulin-β+UEC1;在不同花組織器官樣品集中,最適內(nèi)參基因組合為EF1a+Tubulin-β;在馬纓杜鵑成年植株不同組織部位樣品集中,最適內(nèi)參基因組合為UEC1+ GAPDH+ TIP41+UEP 在馬纓杜鵑幼年植株不同組織部位樣品集中,最適內(nèi)參基因組合為GAPDH+ UEC1;在成年與幼年植株所有樣品集中,最適內(nèi)參基因組合為GAPDH+Actin。3.選擇表達(dá)穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因GAPDH檢測(cè)干旱響應(yīng)基因NCED1在不同干旱脅迫處理時(shí)間下的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)NCED1在第9-13天中的表達(dá)符合預(yù)期趨勢(shì)。在此基礎(chǔ)上,篩選出表達(dá)穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因組合為Actin+UEC1表達(dá)穩(wěn)定性較差的內(nèi)參基因組合TIP41+UEC2 通過比較兩個(gè)內(nèi)參組合在干旱響應(yīng)基因NCED1的表達(dá)模式,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Actin、UEC1是無(wú)論是作為組合還是單個(gè)內(nèi)參,NCED1的表達(dá)豐度都較高,且符合預(yù)期表達(dá)趨勢(shì)。以上研究結(jié)果促進(jìn)馬纓杜鵑關(guān)于內(nèi)參基因研究方面的研究進(jìn)展,也為其他杜昌鵑屬植物基因表達(dá)內(nèi)參基因篩選方面研究提供一定的技術(shù)參考。
【學(xué)位單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S685.21
【部分圖文】：

試驗(yàn)所用馬纓杜鵑成年植株材料采集于金殿風(fēng)景名勝區(qū)生長(zhǎng)狀態(tài)良好、花芽??發(fā)育正常的，樹齡達(dá)５０年的馬纓杜鵑植株（圖１）；馬纓杜鵑幼株材料取材于云南??省農(nóng)業(yè)科學(xué)研宄院晉寧大春禾試驗(yàn)基地栽培的３年生盆栽馬纓杜鵑植株（圖２）。??麵??圖１．馬纓杜鵑成年植株??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ａｄｕｌｔ?ｐｌａｎｔｓ?ｏｆ?Ｒ．ｄｅｌａｖａｙｉ??嘗??圖２．馬纓杜鵑盆栽幼株??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｙｏｕｎｇ?ｐｏｔｔｅｄ?ｐｌａｎｔｓ?ｏｆ?Ｒ．ｄｅｌａｖａｙｉ??１０??

２．１．１植物材料??試驗(yàn)所用馬纓杜鵑成年植株材料采集于金殿風(fēng)景名勝區(qū)生長(zhǎng)狀態(tài)良好、花芽??發(fā)育正常的，樹齡達(dá)５０年的馬纓杜鵑植株（圖１）；馬纓杜鵑幼株材料取材于云南??省農(nóng)業(yè)科學(xué)研宄院晉寧大春禾試驗(yàn)基地栽培的３年生盆栽馬纓杜鵑植株（圖２）。??麵??圖１．馬纓杜鵑成年植株??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ａｄｕｌｔ?ｐｌａｎｔｓ?ｏｆ?Ｒ．ｄｅｌａｖａｙｉ??嘗??圖２．馬纓杜鵑盆栽幼株??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｙｏｕｎｇ?ｐｏｔｔｅｄ?ｐｌａｎｔｓ?ｏｆ?Ｒ．ｄｅｌａｖａｙｉ??１０??

第三章結(jié)果分析??３．１馬纓杜鵑總ＲＮＡ的提取??從ＲＮＡ條帶的完整性來(lái)看，１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖３）：所提取馬??纓杜鵑總ＲＮＡ的１８Ｓ與２８Ｓ兩條帶明亮清晰，無(wú)彌散、拖尾現(xiàn)象，且２８Ｓ條帶的??亮度是１８Ｓ條帶亮度的兩倍，說(shuō)明所提�。遥危镣暾暂^好，無(wú)降解；從ＲＮＡ的??純度與濃度來(lái)看，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)ＮＤ２０００檢測(cè)結(jié)果顯示，馬纓杜鵑總??ＲＮＡ的濃度均在４００？９００ｎｇ／ｎＬ之間，ＯＤ２６?０／２８０的比值在１．８？２．０之間，說(shuō)明??ＲＮＡ沒有蛋白質(zhì)、ＤＮＡ等污染。綜合ＲＮＡ的完整性與純、濃度結(jié)果來(lái)看，所提??取ＲＮＡ可用于后續(xù)的檢測(cè)。??Ｍ?１?２??１０００?ｂｐ?—＾??７５０?ｂｐ???５００?ｂｐ????圖３．?ＫＮＡ瓊脂糖凝膠電泳圖??（注：Ｍ：ＯＤ２０（＞０?ＤＩＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；丨￣２?為部分馬纓杜鵑?ＲＮＡ）??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｆｏｒ?ＲＮＡ??Ｎｏｔｅ：?Ｍ：?ＯＤ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?？２?ｉｓ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ｖ？．辦／ａｖ，“ｊ，／??３．２引物擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性檢測(cè)??３．２．１候選內(nèi)參基因與干旱響應(yīng)基因引物的擴(kuò)增效率檢測(cè)??經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)后，如表３所示：各候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均在??９４?％?￣?１０６?％之間
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2842914