柑橘是我國(guó)重要的水果,甜橙是最主要的栽培類(lèi)型。低溫是影響甜橙生產(chǎn)的重要環(huán)境因子,采用基因工程是提高抗寒性的一個(gè)可行手段,其前提是具備抗寒關(guān)鍵基因。甜橙全基因測(cè)序完成為闡明甜橙低溫應(yīng)答的機(jī)制、發(fā)掘和鑒定抗寒基因奠定了重要基礎(chǔ)。多胺在植物逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,ADC(精氨酸脫羧酶)是多胺合成的重要限速酶,CBFs是植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控因子,但CBF是否調(diào)控ADC基因表達(dá)和多胺合成進(jìn)而介導(dǎo)甜橙低溫應(yīng)答并不清楚。本研究以甜橙CBF與ADC為研究切入點(diǎn),研究CBF調(diào)控低溫下ADC基因表達(dá)及腐胺積累的功能,主要研究結(jié)果如下:1.CsCBFs能夠響應(yīng)多種非生物脅迫,包括低溫、鹽、ABA、脫水等,其中CsCBF1受低溫誘導(dǎo)最明顯。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了超表達(dá)CsCBF1的甜橙轉(zhuǎn)基因系,同是利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)獲得了枳干涉PtrCBF1(CsCBF1同源基因)的干涉植株。2.對(duì)甜橙轉(zhuǎn)基因系和枳VIGS系進(jìn)行抗寒功能鑒定,低溫處理之后,相對(duì)于野生型甜橙(WT),超表達(dá)CsCBF1的甜橙轉(zhuǎn)基因系體內(nèi)積累更少的過(guò)氧化氫,抗氧化酶活性更高,ADC表達(dá)量和內(nèi)源腐胺含量均高于WT;相反,枳干涉系受低溫傷害的表型比對(duì)照嚴(yán)重,積累的ROS更多,但腐胺含量則減少。3.對(duì)枳VIGS植株外源施加腐胺,甜橙轉(zhuǎn)基因系則采用ADC抑制劑(Darginine)處理(均設(shè)置清水處理為對(duì)照組),隨后進(jìn)行低溫處理。發(fā)現(xiàn)外源添加腐胺后,VIGS植株內(nèi)源腐胺含量增加,低溫處理后積累的過(guò)氧化氫比對(duì)照組少,而抗氧化酶活性增加,表明外源腐胺能夠恢復(fù)VIGS植株的抗寒性。Darginine處理的植株耐寒性均不如對(duì)照組,超表達(dá)甜橙轉(zhuǎn)基因系和WT葉片出現(xiàn)干枯和萎蔫,但抑制劑處理材料內(nèi)源腐胺含量比對(duì)照低。4.凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)表明CsCBF1和ADC啟動(dòng)子上的CCGAC元件能特異結(jié)合。綜合以上結(jié)果,表明CsCBF1通過(guò)和ADC啟動(dòng)子上的CRT/ERF元件結(jié)合,調(diào)控ADC表達(dá)和腐胺合成,從而在低溫應(yīng)答中發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S666.4
【部分圖文】：

圖 1-1 多胺合成及分解代謝過(guò)程Figure 1-1 Polyamine biosynthesis and catabolism processes1.2.1.2 多胺的分解腐胺經(jīng)過(guò)含銅的二胺氧化酶（diamine oxidase, DAO）催化后氧化脫氨形成H2O2、NH3和 4-氨基丁醛（4-aminobutanal）。而精胺和亞精胺則是在黃素蛋白多胺氧化酶（polyamine oxidase, PAO）的催化作用下生成 4-氨基丁醛 、1, 3-二氨基丙烷（1, 3-Diaminopropane, Dap）、4 -（3 -氨丙基）-氨基丁醛和過(guò)氧化氫。其中，精胺氧化酶也會(huì)參與到精胺和亞精胺的通路中（Wang et al 2001, Vujcic et al 2002,CerveIIi et al 2003）。1.2.2 多胺和植物逆境脅迫的響應(yīng)

圖 2-1 pBI121 載體示意圖Figure 2-1 Schematic diagrams of vectors pBI121轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒 pBI121- CsCBF1 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株 G-80℃冰箱中的農(nóng)桿菌感受態(tài)拿出放在冰上凍融 5 L的重組質(zhì)粒，冰上反應(yīng) 30 min。中快速冷凍 3 min。水浴鍋中 5 min。0 L -1000 L 不含任何抗生素的 LB 液體培里振蕩 5h。000 r/min 離心 1 min，棄上層清液 400 L，余下菌

先短暫升高，而后表達(dá)量下降，在處理 3 d 時(shí)候表達(dá)量趨3 除了在 12 h 的時(shí)候表達(dá)量有所降低之外，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均略高于呈上升的趨勢(shì)。CBF4 在 2 h 表達(dá)量降低，隨 后有所上升，在 6 h 表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)，表達(dá)模式跟 ABA 處理類(lèi)似呈波浪形。干旱處理后，CBF1 顯著被誘導(dǎo)，并在 2 h 有所下降之后 6 h表達(dá)量達(dá)到有所下降但是仍然高于處理前的表達(dá)量。CBF2 在 2 h 的時(shí)候有一個(gè)迅速后又迅速降低，但是最終呈表達(dá)量上升的趨勢(shì)。CBF3 先下降后緩慢上4 在 2 h同樣有迅速上升的趨勢(shì)而后又快速下降，與 0 h持平�？偨Y(jié)來(lái)看，低溫處理之下，CBF1、CBF2和 CBF3 均有不同程度的上升，1 表達(dá)量是其他基因的兩倍左右。CBF2 和 CBF3 的表達(dá)量受到 ABA 處理CBF4 的誘導(dǎo)程度不如 CBF1 的高。CBF1 和 CBF2 在鹽脅迫處理之下表制，但是 CBF1 受干旱誘導(dǎo)明顯，分別是 CBF2、CBF3、CBF4 的 4倍、。
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2 韓爽;于文靜;楊瑞林;多麗波;李桂玲;陳淑娟;欒英;;多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌ADC型AmpC酶基因的檢測(cè)研究[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2015年67期

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1 何鳳;甜橙CsCBF1調(diào)控ADC基因表達(dá)及腐胺合成的功能解析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 韓路亞;轉(zhuǎn)ADC基因扇子花‘Dream Blue’在低溫干旱脅迫下的生理響應(yīng)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2842591