發(fā)布時(shí)間：2020-09-25 16:33

　　 大蒜(Allium sativum L.)是重要的藥食兼用蔬菜,在世界各地廣泛栽培和食用,我國是大蒜主要生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國。但大蒜主要以鱗莖進(jìn)行無性繁殖,不僅繁殖系數(shù)低,生產(chǎn)成本高,而且極易積累病毒,造成種性退化,產(chǎn)量降低,品質(zhì)下降。組織培養(yǎng)技術(shù)是大蒜脫毒快繁和品種提純復(fù)壯的有效手段,但在這一過程中存在嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象,限制組培技術(shù)在脫毒快繁中的應(yīng)用。玻璃化試管苗形態(tài)異常,代謝紊亂,分化能力低下,增殖、成芽和生根成苗困難,移栽后難以成活,或成苗弱,生產(chǎn)潛力低,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外對植物試管苗玻璃化發(fā)生原因進(jìn)行了廣泛研究,其中植物內(nèi)源激素的作用也引起了人們的關(guān)注。脫落酸作為5大激素之一,不僅在植物適應(yīng)外界環(huán)境中發(fā)揮重要作用,而且也調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個(gè)階段。雖然脫落酸作為外源調(diào)節(jié)物質(zhì)已應(yīng)用于植物組織培養(yǎng),但關(guān)于脫落酸影響玻璃化發(fā)生的研究還少有報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),高濃度的H202會顯著提高試管苗玻璃化率。因此,本研究從脫落酸和H202作用角度,對試管苗玻璃化的發(fā)生機(jī)理和調(diào)控技術(shù)進(jìn)行探討,研究對試管苗玻璃化的防控具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。本試驗(yàn)以大蒜品種'二水早'為材料,測定大蒜試管苗玻璃化過程中玉米素核苷(ZR)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)等內(nèi)源激素含量的變化,分析其與玻璃化的關(guān)系;進(jìn)一步分析外源ABA和H202對大蒜試管苗玻璃化和抗氧化系統(tǒng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要研究結(jié)果如下:1.測定大蒜正常試管苗和玻璃化試管苗內(nèi)源激素的變化。研究發(fā)現(xiàn),對于不同玻璃化程度(輕度、中度和重度)的試管苗,在繼代培養(yǎng)第16 d,玻璃化試管苗中ABA含量均顯著低于正常試管苗;中度和重度玻璃化試管苗ZR顯著高于正常試管苗,且隨玻璃化程度加重,ZR含量越高;而IAA和GA3與正常試管苗相比含量變化不一致。在繼代培養(yǎng)過程中(0-16 d),玻璃化試管苗中ABA含量在培養(yǎng)后期(8-16 d)明顯低于正常試管苗;而玻璃化試管苗的ZR含量均高于正常試管苗;玻璃化試管苗的IAA/ZR均高于正常試管苗,而ZR/ABA均低于正常試管苗;推測ZR含量升高和ABA含量降低是導(dǎo)致試管苗玻璃化的重要因素。2.研究了外源ABA對大蒜試管苗玻璃化的影響及最佳處理濃度。研究表明,在培養(yǎng)基中添加適宜濃度外源ABA,可有效抑制大蒜試管苗玻璃化,以0.1和0.5 mg.L-1的ABA抑制效果最好,玻璃化率最低。其中,0.5 mg·L-1 ABA處理能顯著提高試管苗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。3.研究了外源H202、ABA及H202+ABA處理對大蒜試管苗玻璃化的影響。研究表明,與對照相比,外源ABA單獨(dú)處理可顯著降低試管苗玻璃化率,H2O2單獨(dú)處理顯著增加了大蒜試管苗玻璃化率,ABA可顯著降低由H202引起的試管苗玻璃化率的增加。ABA處理能顯著降低試管苗O2·-產(chǎn)生速率、H202含量、丙二醛(MDA)含量和質(zhì)膜透性,這可能是試管苗玻璃化率顯著降低的原因。與對照相比,外源ABA單獨(dú)處理可顯著提高試管苗SOD、CAT、POD、APX和GR活性,提高AsA和GSH含量;與單獨(dú)H202處理相比,H202+ABA處理8-16 d,能顯著提高試管苗SOD、CAT、POD、APX活性和AsA、GSH含量。綜上所述,外源ABA可以提高試管苗抗氧化能力,減少活性氧的積累,從而抑制玻璃化發(fā)生。4.研究了外源H2O2、ABA及H2O2+ABA處理后試管苗中抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)變化。研究表明,經(jīng)ABA處理,大蒜試管苗中POD和GR在處理后0.5 d其相對表達(dá)量達(dá)到最高值,SOD和APX基因在處理后8 d時(shí),其相對表達(dá)水平達(dá)到最高值,RBOH表達(dá)量在處理后0.5 d達(dá)到最高值,而后降低,在處理1-16 d均低于對照;經(jīng)H202處理,試管苗SOD相對表達(dá)量在處理后0.5 d達(dá)到最高值,CAAT和APX在處理后12 d,其相對表達(dá)量達(dá)到最大,在處理后8-12 dRBOH表達(dá)量均高于對照,并在第8 d達(dá)到最高值;在培養(yǎng)基中同時(shí)添加H202和ABA,C4T相對表達(dá)量在處理1 d時(shí),其相對表達(dá)水平達(dá)到最高值,SOD和GRR基因在處理12 d時(shí)相對表達(dá)水平達(dá)到峰值,RBOH表達(dá)受到抑制,均低于對照。綜上所述,外源ABA能通過抑制試管苗RBOH的表達(dá),誘導(dǎo)SOD C4T、POD、APX和GRR的表達(dá),來增強(qiáng)試管苗抗氧化能力,減少試管苗玻璃化率。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S633.4
【部分圖文】：

逡逑下圖為不同激素間比值的變化（圖２－３）。在培養(yǎng)過程中玻璃化試管苗的ＩＡＡ／ＺＲ逡逑（圖２－３，邋Ａ）均低于正常試管苗，推測內(nèi)源ＩＡＡ／ＺＲ比值維持在９－１２之間，試管苗則逡逑能正常生長不發(fā)生玻璃化。而玻璃化試管苗的ＺＲ／ＡＢＡ在培養(yǎng)期間均高于正常試管苗逡逑（圖２－３，邋Ｂ）。說明試管苗內(nèi)ＺＲ和ＡＢＡ含量的平衡也會影響玻璃化的發(fā)生，正常的逡逑ＺＲ／ＡＢＡ為０．１１－０．１７，大于這個(gè)范圍則會發(fā)生玻璃化。在培養(yǎng)４－１２邋ｄ，玻璃化試管苗的逡逑ＩＡＡ／ＡＢＡ邋（圖２－３，Ｃ）和ＧＡ３／ＡＢＡ邋（圖２－３，邋Ｄ）的值均逐漸升高，而正常試管苗均逡逑逐漸降低。逡逑１４「八邐１00「Ｂ逡逑１２邋１邐＋正~|苗＋~J翻邐＜逡逑＞邐＞逡逑曬：ｓ邋＾邐ｂ邐／邐＼邐■邋ｓ７０邋［邐／邐ｂ逡逑２邋ｒ邐￣邐３0逡逑0邋＾邐＊邐＾邐■■邐；邐２邋０邋；邐１邐１邐１邐１逡逑０邐４邐８邐１２邐１６邐０邐４邐８邐１２邐１６逡逑６０「Ｃ邐９「Ｄ逡逑５５邋－逡逑？５０邋－邐＞邐８邋ａｂ邐，逡逑５卜邋Ｖ邋＼逡逑爸邋２０邋

２．４不同處理下大蒜試管苗內(nèi)源（Ｖ和Ｈ２０２的組織化學(xué)檢測逡逑氮藍(lán)四唑（ＮＢＴ）在０２＿作用下還原生成藍(lán)色甲腙，根據(jù)染色程度判斷ＡＢＡ、逡逑Ｈ２０２＋ＡＢＡ和Ｈ２０２處理對（Ｖ產(chǎn)生的影響。由圖３－４發(fā)現(xiàn)，對照的試管苗染色程度相對逡逑較輕，染色部位也相對較�。▓D３－４，邋Ａ）；而外源Ｈ２０２處理的試管苗染色最深，全株逡逑幾乎都被染色（圖３－４，邋Ｂ）；與添加外源Ｈ２０２的處理相比，外源Ｈ２０２＋ＡＢＡ處理試管逡逑苗染色程度明顯減弱，染色面積明顯減少，僅部分葉片上半部被染色（圖３－４，邋Ｃ）；逡逑外源ＡＢＡ處理試管苗在４種處理中染色程度最輕，染色比例最小，僅植株基部和部分逡逑葉尖被染色（圖３－４，邋Ｄ）。說明ＡＢＡ不僅可以抑制試管苗（Ｖ的產(chǎn)生，還可以抑制外源逡逑Ｈ２０２對內(nèi)源ＣＶ產(chǎn)生的促進(jìn)作用。逡逑根據(jù)棕褐色可以判斷試管苗的Ｈ２０２含量。圖３－５結(jié)果顯示，對照試管苗部分染色，逡逑僅植株基部和葉尖被染色（圖３－５，邋Ａ）；外源Ｈ２０２處理的試管苗整株都被染色，植株逡逑染為棕色（圖３－５

逡逑乎沒有被染色（圖３－５，邋Ｄ）。說明ＡＢＡ不僅可以抑制試管苗內(nèi)源Ｈ２０２的產(chǎn)生，還可以逡逑減少外源Ｈ２０２誘導(dǎo)的內(nèi)源Ｈ２０２的積累。逡逑＼邋Ａ邐Ｂ邋＾邋Ｃ邐Ｄ逡逑ｍ逡逑圖３－４不同處理下的大蒜試管苗0，產(chǎn)生的組織化學(xué)檢測逡逑Ａ：對照；Ｂ：Ｈ２０２處理；Ｃ：Ｈ２０２＋ＡＢＡ處理；Ｉ）：ＡＢＡ處理逡逑Ｆｉｇ．邋３－４邋Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋０２邋＇邋ｉｎ邋ｇａｒｌｉｃ邋ｐｌａｎｔｌｅｔ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ：邋Ｂ：邋Ｈ，０２：邋Ｃ：邋Ｈ，０，＋ＡＢＡ；邋Ｄ：邋ＡＢＡ逡逑曑ＩＢ逡逑圖３－５不同處理下的大蒜試管苗Ｈ２０２產(chǎn)生的組織化學(xué)檢測逡逑Ａ：對照；Ｂ：Ｈ２０２處理；Ｃ：Ｈ２０２＋ＡＢＡ處理；Ｄ：ＡＢＡ處理逡逑Ｆｉｇ．邋３－５邋Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｈ２Ｏ２邋ｉｎ邋ｇａｒｌｉｃ邋ｐｌａｎｔｌｅｔ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ：邋Ｂ：邋Ｈ２０２；邋Ｃ：邋ＩＩ２０２＋ＡＢＡ：邋Ｄ：邋ＡＢＡ逡逑２．５不同處理對大蒜試管苗ＭＤＡ含量和質(zhì)膜透性的影響逡逑整個(gè)處理過程中，各處理的ＭＤＡ含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（３－６，邋Ａ）。處逡逑３１逡逑

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本文編號：2826801