本研究以牡丹內(nèi)源酚類物質(zhì)和吲哚乙酸(IAA)為原料,在多酚氧化酶(PPO)的作用下,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離提純和結(jié)構(gòu)的鑒定。同時(shí),通過對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物生理活性的鑒定和與牡丹試管苗不定根發(fā)生關(guān)系等方面的研究,初步揭示了牡丹試管苗生根過程中內(nèi)源酚類物質(zhì)代謝和根系發(fā)生的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:(1)牡丹內(nèi)源二元酚(綠原酸、咖啡酸和兒茶酚)均可與IAA在PPO的作用下發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生三種新的物質(zhì)。即反應(yīng)24 h后,在5.572 min(產(chǎn)物I)、8.035 min(產(chǎn)物II)和9.045 min(產(chǎn)物III)處出現(xiàn)三個(gè)新的色譜峰。通過對(duì)三個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行分離提純發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物I和產(chǎn)物II的紫外吸收完全一致,均在216和279 nm有紫外吸收峰,且產(chǎn)物I和產(chǎn)物II同時(shí)存在,互相轉(zhuǎn)化,說明產(chǎn)物I和產(chǎn)物II互為同分異構(gòu)體;而產(chǎn)物III在242、260和298 nm有紫外吸收峰。通過液相質(zhì)譜聯(lián)用儀發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物I在正離子模式下的質(zhì)荷比[M+H]+m/z:169.0497,且通過紅外光譜分析可知,產(chǎn)物I含有苯環(huán)結(jié)構(gòu),核磁共振分析可知,產(chǎn)物I含有甲氧基官能團(tuán),綜合推測產(chǎn)物I為4,5-二甲氧基-1,2-苯醌。產(chǎn)物III在正離子模式下的質(zhì)荷比[M+H]+m/z:146.1128,熔點(diǎn)在195-198℃之間,且通過核磁共振和熱裂解-氣質(zhì)聯(lián)用分析可知,產(chǎn)物III為吲哚-3-甲醛。(2)通過產(chǎn)物和IAA的生理活性比較發(fā)現(xiàn),不同濃度產(chǎn)物I在24 h和48 h對(duì)小麥芽鞘伸長量和對(duì)照差異不顯著,表明產(chǎn)物I促進(jìn)小麥芽鞘伸長的作用不明顯;不同濃度產(chǎn)物I對(duì)綠豆插條生根率的影響差異不顯著,整體高于對(duì)照,但生根率最大值仍出現(xiàn)在IAA的處理中,表明產(chǎn)物I對(duì)綠豆插條生根有一定的促進(jìn)作用,但低于IAA。不同濃度產(chǎn)物III處理小麥48 h后,濃度為10~(-1)和10~-22 mmol·L~(-1)的處理小麥芽鞘的伸長量與對(duì)照差異顯著,但整體低于IAA處理,表明產(chǎn)物III促進(jìn)小麥芽鞘伸長的作用顯著,但低于IAA;產(chǎn)物III濃度為10~(-2)和10~-33 mmol·L~(-1)的處理綠豆下胚軸生根率最高,顯著高于對(duì)照,但與IAA10~-44 mmol·L~(-1)的處理差異不顯著,表明產(chǎn)物III促進(jìn)綠豆插條生根的作用高于IAA,但二者無顯著差異。綜上表明,促進(jìn)伸長的能力:IAA產(chǎn)物III產(chǎn)物I,促進(jìn)生根的能力:產(chǎn)物IIIIAA產(chǎn)物I。(3)在培養(yǎng)基中添加不同濃度產(chǎn)物進(jìn)行生根培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),隨著產(chǎn)物I濃度的升高,牡丹試管苗生根率先升高后降低,且在濃度為3 mg·L~(-1)時(shí)達(dá)到最大值26.92%,顯著低于IAA 3mg·L~(-1)處理;隨著產(chǎn)物III濃度的升高,生根率也逐漸提高,且在產(chǎn)物III的濃度為4 mg·L~(-1)時(shí),生根率達(dá)最大值,但與IAA處理無顯著差異。對(duì)生根期間酶活性進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn),不同處理間差異較大,其中POD活性在0-5 d的變化趨勢整體一致,根原基誘導(dǎo)期(3-5 d)波動(dòng)較大,產(chǎn)物III和IAA處理均在第3 d POD活性達(dá)到最大值,且產(chǎn)物III高于IAA處理;在PPO活性方面,各處理間的變化趨勢差異不大,同樣IAA和產(chǎn)物III處理在第3 d達(dá)到峰值,且產(chǎn)物III處理活性更高,而此時(shí)對(duì)照的活性處于最低值;IAAO活性整體在較小的范圍內(nèi)波動(dòng),在根原基誘導(dǎo)期(3-5 d)產(chǎn)物I、III和IAA處理活性整體都處于下降趨勢,且產(chǎn)物III處理下活性最低。(4)采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)植物內(nèi)源玉米素(ZT)、赤霉素(GA_3)、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、吲哚丁酸(IBA)和水楊酸(SA)6種激素進(jìn)行檢測方法的考察和建立,研究表明6種激素的保留時(shí)間分別為ZT:0.51 min、GA_3:2.12 min、IAA:2.71 min、ABA:3.03 min、IBA:3.70 min和SA:4.74 min,5 min之內(nèi)可完成檢測且分離效果較好。通過對(duì)流動(dòng)相中不同甲酸(FA)濃度進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)(0‰、0.1‰、0.2‰、0.5‰和1‰),ZT隨著FA濃度的升高,響應(yīng)逐漸降低;GA_3、IAA、ABA和IBA均在0.1‰FA響應(yīng)最高;SA在0.5‰FA響應(yīng)最高,故流動(dòng)相中加入0.1‰FA最適合6種激素的檢測。通過對(duì)牡丹試管苗生根期間內(nèi)源激素含量變化進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),在根原基誘導(dǎo)期(3-5 d)莖基部內(nèi)源IAA的含量處于升高趨勢,玉米素(ZT)在0-10 d莖基部含量一直處于下降趨勢,赤霉素(GA_3)在根原基誘導(dǎo)期處于上下波動(dòng)趨勢,脫落酸(ABA)在0-5 d莖基部含量處于下降趨勢,且含量極低,5-25 d處于升高趨勢。通過免疫熒光定位法發(fā)現(xiàn),IAA在三個(gè)部位均以維管束的分布最多,且在莖基部一直作用于根原基形成的部位,信號(hào)的強(qiáng)弱與其含量相一致。(5)通過代謝組學(xué)的方法對(duì)牡丹試管苗根系發(fā)生關(guān)鍵期的內(nèi)源代謝物進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn),在正離子模式下最多可以提取到4752個(gè)離子峰,而負(fù)離子模式下最多可以提取到4740個(gè)離子峰;牡丹試管苗根原基形成期的代謝物主要分布在0.5-2 min、4-7 min和10-14 min之間。通過主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn),生根培養(yǎng)3 d后牡丹試管苗內(nèi)源代謝物并未發(fā)生較大波動(dòng),生根培養(yǎng)5 d后內(nèi)源代謝物差異明顯,且培養(yǎng)天數(shù)和激素處理均區(qū)分明顯,初步推測牡丹試管苗在根原基形成期(3-5 d)內(nèi)源代謝物變化與根系發(fā)生密切相關(guān)。綜上可知,三種二元酚與IAA在PPO的催化下,均可發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生三種同樣的物質(zhì);結(jié)合核磁共振、紅外光譜及質(zhì)譜表明,推測產(chǎn)物I為4,5-二甲氧基-1,2-苯醌,與產(chǎn)物II互為同分異構(gòu)體;產(chǎn)物III為吲哚-3-甲醛。產(chǎn)物I的生長素活性不明顯,對(duì)綠豆不定根的發(fā)生有一定促進(jìn)作用,但低于IAA;產(chǎn)物III具有顯著的生長素活性,但活性低于IAA,對(duì)綠豆不定根發(fā)生的促進(jìn)作用顯著,且高于IAA。添加適宜濃度的產(chǎn)物I對(duì)牡丹試管苗的生根有一定促進(jìn)作用,但生根率顯著低于IAA處理,推測反應(yīng)生成的4,5-二甲氧基-1,2-苯醌可能是生根的一種輔助因子;添加產(chǎn)物III能顯著促進(jìn)牡丹試管苗的生根率,生根率高于IAA處理,但二者差異不顯著。初步推測在PPO的作用下牡丹體內(nèi)的二元酚與IAA發(fā)生反應(yīng),使部分IAA轉(zhuǎn)化為吲哚-3-甲醛,此物質(zhì)亦具有生長素活性,能促進(jìn)根系發(fā)生,但I(xiàn)AAO不能對(duì)其進(jìn)行氧化,從而在根原基誘導(dǎo)期對(duì)IAA的含量起到一定的保護(hù)作用,維持體內(nèi)生長素類物質(zhì)的水平,進(jìn)而促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S685.11
【部分圖文】：

產(chǎn)物 III 質(zhì)譜表征產(chǎn)物III進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物III在[M+H]+和[M-H]-模式下的一級(jí)質(zhì)荷比]+m/z：146.0502（圖 3-6-A）和[M-H]-m/z：144.0460（圖 3-7-A）；從二級(jí)離子模式下的主要子離子為 91.0352、118.0385（圖 3-6-B），負(fù)離子下的主要429、144.0457（圖 3-7-B）。產(chǎn)物 III 真空熱裂解-氣質(zhì)聯(lián)用（PY-GC-MS）表征樣品在真空環(huán)境下進(jìn)行熱裂解分析可知，產(chǎn)物 III 在氣相中的色譜出峰時(shí)間3-7-A），通過與氣質(zhì)自帶的 NIST 數(shù)據(jù)庫匹配發(fā)現(xiàn)，推測該化合物為吲哚-3-甲主離子峰為：m/z 144.06，子離子峰為：m/z 89.07 和 116.06，與核磁圖結(jié)果吻甲醛的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜進(jìn)樣比對(duì)發(fā)現(xiàn)其一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖完全一致。在 HPL進(jìn)樣發(fā)現(xiàn)，出峰時(shí)間與紫外吸收與產(chǎn)物 III 完全一致 （圖 3-8-A；圖 3-8-B）間及紫外吸收完全一致。

-A產(chǎn)物III的1H-NMRFig.3-5-AThe1H-NMRfigureofproductIII

-B產(chǎn)物III的13C-NMR圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2826320