雙孢蘑菇采后易褐變,常溫不易貯藏。本課題利用反義RNA技術(shù)獲得抗褐變雙孢蘑菇。將雙孢蘑菇PPO反義抑制表達(dá)載體與增強(qiáng)表達(dá)載體分別以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入As2796雙孢蘑菇中,進(jìn)行栽培出菇試驗(yàn),成功獲得抗褐變耐貯藏的雙孢蘑菇材料。主要研究結(jié)果如下:1、通過研究農(nóng)桿菌菌液侵染不同組織塊,建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙孢蘑菇的高效轉(zhuǎn)基因體系。確定了菌褶是雙孢蘑菇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中最為理想的侵染材料,污染率較低為10.3%。通過轉(zhuǎn)化子經(jīng)出菇試驗(yàn)獲得轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇子實(shí)體,其中菌株Y1-10的產(chǎn)量達(dá)15.32 kg/m~2,比對(duì)照組增產(chǎn)41.5%,菌株Z5-19、Z5-5、Y1-10具有菇柄短小粗壯、菇蓋厚實(shí)肥大等優(yōu)良性狀的潛力,Z5-19菇蓋厚度可達(dá)2.88cm,單菇重量達(dá)4.36g。2、通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇AbPPO1、AbPPO3、AbPPO4、AbPPO5基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)反義抑制轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇PPPO基因表達(dá)量有不同程度上的降低,有65%的反義菌株得到了抑制,反義抑制轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇對(duì)PPO基因抑制表達(dá)程度為50%~75%之間。在增強(qiáng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇中,PPO基因在轉(zhuǎn)錄水平上得到了不同程度的高表達(dá),有87%的增強(qiáng)表達(dá)菌株得到高表達(dá)。3、在對(duì)轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇抗褐變性狀研究中通過分析子實(shí)體的硬度、菇蓋白度、切面褐變發(fā)現(xiàn):增強(qiáng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇在硬度值方面顯著優(yōu)于反義抑制轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇和CK,其中增強(qiáng)表達(dá)菌株Z-5-5的硬度值最大為4.5N,CK硬度值為2.9N,菌株Z5-5、Z5-19、Z6-9在貯藏5天后菇蓋白度值在80~82.5之間依然處于消費(fèi)者可接受范圍內(nèi),明顯高于對(duì)照組CK。并且菇蓋白度和硬度值兩者具有高度相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)值高達(dá)0.73,菌株Z5-5、Z5-19、Z6-9所表現(xiàn)出的抗褐變耐貯藏性與其具有高硬度的特性有著密切的聯(lián)系。
【學(xué)位單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

反義 PPO 轉(zhuǎn)雙孢蘑菇的獲得及抗褐變特性研究2.4.1 農(nóng)桿菌檢測(cè)分析為驗(yàn)證質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，分別進(jìn)行農(nóng)桿菌菌液 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖 2.1，擴(kuò)增條帶正確，可以用來進(jìn)行后續(xù)雙孢蘑菇子實(shí)體遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。M antiP1 antiP2 antiP3 antiP4 P5 P62.4 結(jié)果分析

圖 2.1 農(nóng)桿菌菌液 PCR 檢測(cè)Figure 2.1 PCR detection ofAgrobacterium plasmid注: M. DL2000 Marker2.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)雙孢蘑菇子實(shí)體的遺傳轉(zhuǎn)化分析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染后的雙孢蘑菇外植體，需在含有無菌濾紙的 CM 固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng) 24 h，共培養(yǎng)結(jié)束后，在含有 Hyp 30 mg/L、Cef 200 mg/L CM培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次篩選培養(yǎng)；25℃培養(yǎng) 20d 左右菌絲長(zhǎng)至 2~3cm 后，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌絲轉(zhuǎn)移至 Hyp 45 mg/L、Cef 200 mg/L CM 培養(yǎng)基上進(jìn)行第二次篩選；25℃培養(yǎng) 15~20d 左右菌絲長(zhǎng)至 2~3 cm，篩選結(jié)束，將長(zhǎng)勢(shì)良好的菌絲轉(zhuǎn)移至空白 CM 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20d 左右，保存菌種。培養(yǎng)結(jié)果如圖 2-2。

侵染組織塊 個(gè)數(shù) 污染數(shù) 污染率（%）（mm/d）菌褶 87 9 10.3 2.3±0.42生長(zhǎng)點(diǎn) 76 7 9.2 1.0±0.28菌絲球 81 20 24.7 1.3±0.14農(nóng)桿轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇抗性菌絲篩選過程中，不同篩選階段，雜菌污染情況也不相同。第一次篩選培養(yǎng)時(shí)期的污染情況，主要是農(nóng)桿菌污染，表現(xiàn)為外植體周圍有粘稠狀乳白色液體；第二次篩選培養(yǎng)時(shí)期的污染情況，主要為農(nóng)桿菌和霉菌；篩選后在空白培養(yǎng)基的復(fù)壯階段，主要為霉菌污染，主要表現(xiàn)為菌絲周圍有綠色、黃色、黑色等分生孢子出現(xiàn)。2.4.3 抗潮霉素陽性轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果用改良 CTAB 法提取轉(zhuǎn)化子的 DNA，使用潮霉素引物對(duì)其進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增引物序列為 Hypf:CCCTTATCTGGGAACTACTC，Hypr: GTTATGTTTATCGGCACT-TT，擴(kuò)增結(jié)果如圖 2.3 所示：泳道 1、2、3、5、6、8 為陽性轉(zhuǎn)化子。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2821491