蘭科植物(Orchidaceae)為單子葉植物中最大的一個科,其花形奇特且花色豐富,大部分為兩側對稱花且具有1枚高度特化的唇瓣,具有較高的觀賞價值和經濟價值。蝴蝶蘭(Phalaenopsis)是蘭科植物中產業(yè)化程度最高的蘭科觀賞植物,其生長周期相對較短,快繁體系也日趨成熟,以蝴蝶蘭作為研究材料將有利于對蘭科基因功能進行分析。目前關于蝴蝶蘭CYC-like基因作用機制研究較少。本研究通過對蘭科TCP基因進行生物信息學分析并以蝴蝶蘭為試驗材料,分離了 3個CYC-like基因并對其進行序列分析及表達特征研究,進一步構建正義表達載體,將PhCYCs分別轉化夏堇,并對轉基因植株進行性狀觀察和表達分析,初步確定了其功能,為蘭科花卉CYC-like基因功能研究提供了理論依據(jù)。主要研究結果如下:1、通過對單雙子葉CYC/TB1基因進行比較,發(fā)現(xiàn)單雙子葉CYC/TB1基因在進化過程中出現(xiàn)功能分化,且單子葉CYC/TB1基因仍保留CYC功能。蘭科10個屬植物TCP基因的序列比對及系統(tǒng)進化分析結果顯示,其TCP基因高度保守,CYC/TB1基因在進化過程中存在復制及分化。對蝴蝶蘭TCP基因進行motif分析預測和TCP結合位點分析,發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭CYC/TB1基因均包含TCP結構域和R結構域,在兩者之間還存在假定ECE motif(motif 3),且CYC/TB1基因的啟動子區(qū)域存在假定CYC結合位點。初步認定蝴蝶蘭CYC/TB1基因仍保留CYC基因參與花對稱性發(fā)育的功能。2、根據(jù)小蘭嶼蝴蝶蘭全基因組測序結果,從蝴蝶蘭雜交種'火鳳凰'中克隆到3個CYC同源基因,分別命名為PhCYC1、PhCYC2和PhCYC3,其中PhCYCl基因開放閱讀框(ORF)為867bp,編碼288個氨基酸;PhCYC2基因開放閱讀框(ORF)為1005bp,編碼334個氨基酸;PhCYC3基因開放閱讀框(ORF)為975bp,編碼324個氨基酸。且PhCYCs與金魚草的AmCYC(56.20%)以及玉米的ZmTB1(50.38%)具有較高的同源性。系統(tǒng)進化分析顯示,PhCYC1、PhCYC2、PhCYC3同源性較高,與蘭科植物及其他物種的CYC/TB1基因聚類在同一分支下。3、通過酶切位點分析、質粒雙酶切和測序等方法成功構建了正義表達載體pCAMBIA1302-PhCYC1、pCAMBIA1302-PPhCYC2 和 pCAMBIA1302-PhCYC3.亞細胞定位試驗結果表明PhCYCs基因定位于細胞內。半定量及熒光定量結果顯示,PhCYC1和PhCYC2在各時期蝴蝶蘭雜交種花芽中表達基本一致,PhCYC3主要是在早期階段表達(b1-b2)而在后期(b3-b6)表達下降。在蝴蝶蘭雜交種中,PPhCYC2和PhCYC3在所有花器官中表達量均比PhCYC1高。在小蘭嶼蝴蝶蘭中,PEQU_06749(PhCYC2)和PEQU_06750(PhCYC3)在野生型小蘭嶼蝴蝶蘭花瓣中表達高而在三唇瓣突變體的唇瓣狀花瓣中基本不表達,且在突變體的唇瓣中也下降明顯,而PEQU_11715(PhCYC1)的表達則在突變體中上調,此外PhCYC2和PhCYC3在突變體敗育蕊柱中表達上調。CYC-like基因在不同花序分枝類型的蝴蝶蘭雜交種熒光定量分析結果顯示,PPhCYC2和PhCYC3在不分枝大花型的頂端花序(Ⅰ1),去頂大花型抽出的第一級花序(Ⅰ3),多分枝小花型的頂端花序(Ⅰ4)和小花型第一級側花序(Ⅰ5)中表達被抑制,在大花型潛伏花序(Ⅰ2)中表達量高,而PhCYC1在Ⅰ1和Ⅰ2中表達低,當大花型蝴蝶蘭頂端優(yōu)勢被去除,PhCYC1在去頂大花型抽出的第一級花序(Ⅰ3)中明顯提高,且在小花型花序(Ⅰ4和Ⅰ5)中也具有高表達量,結果顯示蝴蝶蘭PhCYCs同時具有CYC、TB1兩方面功能。4、通過農桿菌介導法將蝴蝶蘭PhCYCs基因分別轉化夏堇,經PCR鑒定獲得了轉PhCYCs基因夏堇植株。RT-PCR結果表明,蝴蝶蘭PhCYCs基因在夏堇中能正常轉錄,且不同株系內源基因的表達模式不同。轉基因結果顯示所有轉基因株系的分枝均增多且花型發(fā)生改變,并且轉基因株系變異花型均表現(xiàn)出側部花瓣屬性,初步說明蝴蝶蘭PhCYCs基因既參與花型發(fā)育又調控分枝過程。
【學位單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S682.31
【部分圖文】：

小蘭嶼蝴蝶蘭基因組中找到的３個ＣＦＣ－ｌｉｋｅ基因ＣＰＥ０Ｃ／ＪＭ７辦，和逡逑Ｐ￡０ｉ７＿７ｉ７／５）在內的一些物種的ＣＴＯＴ５／基因部分ＴＣＰ結構域氨基酸序列進行了分逡逑析（圖１－１）。序列比對結果顯示，所有植物ＴＣＰ結構域中均包含一個保守的Ｌ／ＶｘｘＬＬ逡逑ｍｏｔｉｆ，在核心真雙子葉植物ＣＹＣ２分支基因的第一個氨基酸為亮氨酸（Ｌ），而在木蘭逡逑類和單子葉植物中，第一個氨基酸發(fā)生了改變，大部分為纈氨酸（Ｖ），而這種Ｌ／ＶｘｘＬＬ逡逑ｍｏｔｉｆ被認為參與調節(jié)蛋白質互作并且其第一個亮氨酸是決定花冠單對稱性建立的關逡逑鍵氨基酸（Ｈｏｒｎｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）。逡逑表１－１被子植物中ＣＦＣ／７Ｂ７基因比較逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ＣＹＣ／ＴＢ１邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ逡逑ＣＹＣＩＴＢＩ邋ｉｓ￣￣花對稱性相關基因邐表達特征邐參考文獻逡逑Ｓｐｅｃｉｅｓ邐ＣＹＣｉＴＢｌ邋ｇｅｎｅｓ邋Ｆｌｏｒａｌ邋ｓｙｍｍｅｔｒｙ邐Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邐Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ逡逑邐ｒｅｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邐逡逑木義類植物邐木本馬兜鈴邐ＡａｒＣＹＣＵ、２邐ＡａｒＣＹＣＬｌ邐遠軸花被片和蘑菇狀結構的發(fā)邐Ｈｏｍｅｔａｌ．．逡逑ＭａｇｎｏＪｉｉｄｓ邐Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｋｉａ邋ａｒｂｏｒｅａ邐疴。邐２０邋Ｍ逡逑（馬兜鈴科邐Ｔｈｅ邋ａｂａｘｉａｌ邋ｐｅｒｉａｎｔｈ邋ａｎｄ逡逑Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ）邐ｍｕｓｈｒｏｏｍ邐ｍｉｍｉｃｒｖ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．逡逑核心Yg雙斤脈根邐ＬｊＣＹＣ！＇邋２、３、５邐ＬＪＣＹＣ２邐背部花瓣的會育。邐Ｆｅｎｇｅｔ邋ａｌ．

邐邐邋ＡＩ９９０９３３０逡逑圖１－５文心蘭ＴＣＰ基因家族氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄｓ邋ａｎｄ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ邋ｏｆ邋Ｏｎｃｉｄｉｕｍ邋ｈｙｂｒｉｄｕｍ邋ＴＣＰ邋ｇｅｎｅｓ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑0Ｑｉｇ？Ｑ？１１３０９１邐１邋＇邐ｊｊＴ邋ＫｇＬＨｎｉｇｖｆＴＪＲｖ邋Ｓ邋ＴｊＪ邋Ｉ邋Ｑ｛３Ｙ｛ｊＩｊｒ邋ｒ：邋（ＴＯｙＲｃ邋？邋ｇｉＡ邋ＶＤｇｎｉ邋Ｋ邋ａＪＪｄ邋ａＪＪＩａ邋Ｄ０Ｐ邋Ｅ邋Ｌ逡逑Ｄｎｌｇ？ｎ？９３３６１邐１邋ＨＳ邋�。ⅲ斟澹族澹垮澹殄澹常郑澹樱觯樱裕樱桑眩掊澹辏藻澹В樱㈠澹椋椋铃澹蓿辏辏欤耍粒辏粒粒辏叔澹郑猓龋穑拢义希缅澹欤幔螅箦澹桑蛇姡校拢眩眨保梗担矗愤姡边姡剩鳎纾觯椋蓿体遑�！邋Ｖ：邐ＢｖＳ邋Ｔｊｊｌ邋Ｑ０Ｙ邋ｊ邋Ｒ邐ｒ0ＱＰ邐＆ＶＫ邐ＺＫＡｇＡＯＳ邐ＩｄＱｐＢＬ逡逑ｃｃ？ｔｔｋ＊邐ｎｎｉｇ？ｎ？ｉ７２２４邐ｉ＾＾ＫＢｓＳｌｓＥｌ邐ｖ邐ｌｓｑｐ邋ｖｖｄＡ邐ｉｎａＪｏｈｅ邐ｄｘＨｐｐｌ逡逑Ｄｎｉｇ？ｎ？１０４６？２邐１邐■邋２．．’＿邐ＢＡＨＴＳ邋Ｐ邋Ｉ邋Ｒ邋！切卩邋Ｉ邋Ｉ邋ＡＶＤｔ邐ｉ邋ＩＫＮ！邋ＫＰＳ邋叫私。１＊逡逑Ａｔ３ｇｌ５０邋３０邐１邐Ｊ邋ＵＡ／２：邐Ｊ］Ａ：ｉ邋２邋？

根據(jù)７ＴＰ基因家族各分支保守氨基酸差異分析（Ｍａｒｔｉｎ－ＴｒｉｌｌｏａｎｄＣｕｂａｓ，邋２０１０），逡逑我們從小蘭嶼蝴蝶蘭基因組中成功獲得了邋３個ＣＴＣ／Ｔ５／基因，９個Ｃ７Ｗ基因和８個逡逑ＰＣＦ基因（圖１－１１Ａ），并通過在線ｍｏｔｉｆ預測網站ＭＥＭＥ（ＢａｉｌｅｙａｎｄＥｌｋａｎ，邋１９９４）分析逡逑其氨基酸序列（圖１－１１Ｂ和Ｃ）。逡逑＼邐１邋－邋－ＨＴＰＫｌＪｊＷｉＷＪＩＮＲＰＱ邐陽Ｆ｜ｇｙ邋Ｆｇ＾ｊＬＤｇｊｆｆｌＴＫＳＫＥｇｆｌＫＥｇＶＱＳＫＳＳ邋？逡逑１邋－－ＱＡＶＫ＾＾＾＾：邋ＹｇＳＱ邐＾邋ＪＴｇＬＤ＾ＷＴＫＳＫＴＧ邋ＫＥ｜ＪＶＱＳＫＳＴ－逡逑ｗｒｃｒｉ邐ｌ邋－邋－ｋｖｖｆ？ｕａ邋．邋：ｉ３３３ｊ邋＾ＥＩｇｉＣ邋－１邐ｋａ＾ｍ，ｄ＾ｍｋｋｓｒｋＪ邋ｋｅｖｖｑａｋｎｌ－逡逑Ｃｌａｓｓ邋ＩＩ邐＜ＫＫｔ：．ｒｉ邐１邐ＰＲＴ＾＾＾：邐ｒＳａ；邐ＲＤＯＴ３Ｔ？邐３ｒ邐Ｑｆ邐ＫＡ＾0ｆｔ）＾ｍＴＱＳＫＰｒ邐ＤＲｇＡＡＤＰＳＳ－逡逑？ｖｒ？ＲＩ邋．．．邐／ｒｎｌＢＩ邐１邐－邋－邋ＡＡＡＲ｛＾＾＾２邐ｒｋ＾ａＲ邐３ｈ邐Ｑｆ邐ｋａ＾＾Ｒｑ＾ＱｎｔｓｋｓＳ邐ｑｂｉｍａｄｄａｓ－逡逑ｉ邋？＇邋ｉｍｉ－ｎｋｅ邐Ｐｔｇｉ邋

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本文編號：2813586