褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是有效的活性氧清除劑,在逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。同時,它也是重要的活性物質(zhì),調(diào)控植物的生長發(fā)育。在植物中,褪黑素合成路徑已被初步解析。我們首次從珠眉海棠(Malus zumi Mats)中分離了褪黑素關(guān)鍵合成酶基因MzSNAT5、MzASMT1、MzASMT3及MzASMT9。但褪黑素合成調(diào)控的分子機(jī)制仍是空白。我們的研究主要圍繞調(diào)控褪黑素合成的兩條主要途徑:一是通過“轉(zhuǎn)錄調(diào)控”,上調(diào)合成酶基因的表達(dá),提高合成酶蛋白水平的“開源”模式;二是通過“翻譯后調(diào)控”,減少褪黑素合成酶的泛素化降解,延長半衰期的“節(jié)流”模式。植物中褪黑素的合成受強(qiáng)光和黑暗誘導(dǎo),因此,我們猜測響應(yīng)光/暗信號的主要轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控褪黑素合成酶轉(zhuǎn)錄,并進(jìn)行了篩選。在蘋果及模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn),KJ可能是調(diào)控黑暗下褪黑素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。KJ通過直接結(jié)合褪黑素關(guān)鍵合成酶基因啟動子,抑制其表達(dá)和褪黑素合成。此外,本研究分離了 3個與褪黑素合成酶互作的MzWL蛋白,并證實(shí)了 WL通過與褪黑素關(guān)鍵合成酶形成復(fù)合物,減少合成酶的泛素化降解,保證褪黑素合成。本研究對蘋果屬植物中褪黑素合成調(diào)控機(jī)制的揭示,將為分子育種培育高褪黑素含量的轉(zhuǎn)基因蘋果提供理論依據(jù)。結(jié)果如下:1.體外試驗(yàn)表明,褪黑素合成酶MzSNAT5與AtSNAT6、MzASMT3與AtASMT8均能催化褪黑素前體N-乙酰血清素及褪黑素的合成;在體內(nèi)系統(tǒng)中,超表達(dá)AtSNAT6/AtASMT8和異源表達(dá)MzSNAT5/MzASMT3的轉(zhuǎn)基因擬南芥,褪黑素含量顯著升高,證明它們在植物體內(nèi)催化褪黑素合成,編碼褪黑素合成酶。2.體外EMSA試驗(yàn)證明,MzKJ和AtKJ能分別特異性地結(jié)合MzASMT3、AtSNAT6與AtASMT8的啟動子。體內(nèi)ChIP-qPCR試驗(yàn)證明,MzKJ、AtKJ能直接結(jié)合MzASMT3、AtSNAT6與AtASMT8的啟動子。沉默KJ的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷/擬南芥中,合成酶基因表達(dá)增加,褪黑素含量明顯升高;而超表達(dá)KJ使合成酶基因表達(dá)下降,褪黑素含量顯著減少。表明KJ直接結(jié)合褪黑素合成酶基因的啟動子,抑制表達(dá),負(fù)調(diào)控褪黑素合成。3.黑暗誘導(dǎo)了MzASMT3、AtSNAT 與AtASMT8基因的表達(dá),使褪黑素含量明顯增加。黑暗下,KJ蛋白水平下降,因此ChIP-qPCR結(jié)果顯示,它結(jié)合的合成酶基因啟動子也隨之較少。進(jìn)一步證明,黑暗使KJ水平下降,從而減少對褪黑素合成酶基因表達(dá)的抑制,增加植物中褪黑素合成。4.黑暗下,外源褪黑素處理使褪黑素合成酶基因表達(dá)上調(diào),體內(nèi)褪黑素含量明顯增加,并抑制擬南芥幼苗子葉開張。而KJ通過調(diào)控黑暗下褪黑素的合成,影響子葉開張。5.克隆得到3個MzWL基因。蘋果原位BiFC、Co-IP結(jié)果證明,這3個MzWL與MzSNAT5、MzASMT1和MzASMT9互作。泛素化檢測表明,MzWL與合成酶通過形成復(fù)合物,降低合成酶的泛素化降解。綜上所述,黑暗下KJ通過減少對關(guān)鍵合成酶基因表達(dá)的抑制,增加褪黑素合成,并抑制子葉開張;而WL蛋白通過與關(guān)鍵合成酶互作,減少關(guān)鍵合成酶的泛素化降解,保證褪黑素合成。這是首次在植物中,發(fā)現(xiàn)褪黑素合成調(diào)控的分子機(jī)制。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S661.4
【部分圖文】：

最終在Ｎ－乙酰血清素甲氧基轉(zhuǎn)移酶（ＡＳＭＴ）的催化下生成褪黑素。并且，他們發(fā)現(xiàn)，在逡逑沉默７３／／的水稻突變體中，色胺會在ＳＮＡＴ的催化下生成Ｎ－乙酰色胺，而過多Ｎ－乙釀色胺的積累逡逑會抑制ＡＳＭＴ的催化活性，從而抑制褪黑累？合成（圖１－２）。逡逑（Ｂ）邋ｒ邐邋Ｔｉｐ逡逑：ｔｐｈ逡逑５－（）Ｈ－Ｔｒｐ邋Ｔｒｖｐｔａｍｉｎｅ邋邐逡逑＊邋，邐ＡＡＮＡＴ逡逑扣Ｔ５Ｈ逡逑ＩＴＫ邐ｙ逡逑邐＞逡逑Ｉ邐＾逡逑ＡＡＮＡＴ邋＾邐．＼－ａｃｅｔｙｌｔｒ＞ｐｔａｍｉｎｅ逡逑ａｓｍｔ｜邋ｌ＜邐逡逑圖１－２褪黑素在植物體內(nèi)的合成路徑（Ｐａｒｋｅｄ．，邋２０１２ｂ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｍｅｌａｔｏｎｉｎ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋（Ｐａｒｋ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２ｂ）逡逑ｆｆｕ本實(shí)驗(yàn)室也第一次在雙子葉植物蘋果屮成功分離獲得蘋果域褪黑素合成酶基因ｒａｃ、ｒ５ｗ、逡逑與ＡＳＭ；Ｔ（ＬｅｉｅＭ／．，２０１３）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶（ＣＯＭＴ）也能參與植逡逑物屮褪黑素的合成。血清素能夠先在ＡＳＭＴ或Ｃ０ＭＴ的作用下，牛成５－甲l#基色胺（５－ＭＴ），冉逡逑在ＳＮＡＴ作用下，生成褪黑素。因此，植物屮存在多條褪黑素的合成路徑，較動物史為復(fù)雜。逡逑目前，植物屮褪黑素的合成路徑存在多種情況（圖１－３）。Ｋ屮，較為常見的是：底物色氨酸經(jīng)逡逑過“色胺－血清素－Ｎ－乙酰血清素－褪黑素”的傳統(tǒng)路徑

１．２．２植物中褪黑素的合成場所逡逑雖然，植物中褪黑素的合成路徑己被解析，但植物中褪黑素的合成場所一直到近幾年才被發(fā)現(xiàn)。逡逑相比于動物，植物細(xì)胞中褪黑素的含量氋出許多（Ｔａｎ邋ｅ；ａ／．，邋２０１２），這意味著植物和動物中可能存逡逑在不同的機(jī)制來合成褪黑素。Ｋａｎｇ等人（２０１３）發(fā)現(xiàn)，比起動物ＳＮＡＴ，水稻ＳＮＡＴ與藍(lán)藻細(xì)菌ＳＮＡＴ逡逑在進(jìn)化上具有更近的親緣關(guān)系。而藍(lán)藻細(xì)菌能夠合成褪黑素，并在漫長的進(jìn)化過程中，進(jìn)化成了后逡逑代葉綠體，因此，研究者推測，葉綠體可能保留了藍(lán)藻細(xì)菌合成褪黑素的能力，它可能是植物中褪逡逑黑素合成的重要場所之一■邋（Ｔａｎ邋ｅＺａ／．，２０１３，邋２０１４）。這一■猜測在本實(shí)驗(yàn)室（Ｚｈｅｎｇ邋ｅｆ邋ａ／．，邋２０１７ａ）的研逡逑究中被證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn)了，定位于葉綠體中的蘋果屬褪黑素合成酶ＭｚＡＳＭＴ９，并證明了葉綠體能夠逡逑合成褪黑素。這是首次在植物中證明葉綠體是合成褪黑素的主要場所之一。逡逑此外，另一種假說認(rèn)為，在植物中，線粒體也是合成褪黑素的場所之一。根據(jù)內(nèi)共生理論，線逡逑粒體是由一類ａ變形桿菌進(jìn)化而來的，例如紫色非硫細(xì)菌，它能夠合成褪黑素并具有明顯的晝夜節(jié)逡逑律，這表明線粒體很可能仍保留著其前體細(xì)菌合成褪黑素的能力（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒｅｆａ／．，１９９５；Ｅｓｓｅｒｅｆａ／．，逡逑２００４；邋Ｔａｎ扣《／．，２０１３）。因此，研究者推測，在內(nèi)共生的過程中，這種細(xì)菌進(jìn)化成線粒體，并且保逡逑留了其中參與褪黑素合成的基因（Ｔａｎ邋ｅ？ａ／．，邋２０１３，邋２０１４）。進(jìn)一步，我們的研究（Ｗａｎｇ邋ｅｆａ／．，２０１７）逡逑首次在植物中發(fā)現(xiàn)，蘋果屬褪黑素合成酶ＭｚＳＮＡＴ５定位于線粒體中，并首次證明了，在植物中線粒

論文邐第二章黑暗下ＫＪ對褪黑素合成酶合成酶。我們從擬南芥中克隆得到了機(jī)４ＭＳＭ７？基因。Ａ７１邋ｂｐ，編碼２５６個氨基酸，分子量為２８．９２邋ｋＤａ，具有乙�；D(zhuǎn)移酶開放閱讀框?yàn)椋保保玻插澹猓�，編碼３７３個氨基酸，分子量為４０．９４邋ｋＤａ，）。逡逑０．２５

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本文編號：2813565