【摘要】：鎘(Cd)是土壤重金屬主要污染物,同時也是蔬菜的主要重金屬污染物之一。Cd極易富集于蔬菜和其他食物當中,然后通過食物鏈,進入人體或其他生物體當中,對動植物體產生危害,嚴重破壞生態(tài)環(huán)境。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄屬一年生或多年生草本植物,同時也是我國重要的農作物之一。番茄受重金屬毒害后有不同的表現,主要為老葉壞死,新葉失綠,葉柄和葉背面出現紫紅色。2,4-外源表油菜素內酯(2,4-EBL)作為第六大植物激素,對植物生長發(fā)育具有重要的作用。關于2,4-EBL對植物生長發(fā)育的研究已經取得較多進展,然而2,4-EBL對重金屬Cd脅迫下番茄幼苗的作用相關報道卻很少。因此,本實驗以常規(guī)栽培種番茄為實驗材料,試驗分為兩個部分進行:第一部分是用2,4-EBL噴施Cd脅迫后番茄幼苗;第二部分是先用2,4-EBL浸種處理,然后進行Cd脅迫處理。通過研究外源2,4-EBL對Cd脅迫下番茄幼苗的形態(tài)特征、生長狀態(tài)、生理響應以及2,4-EBL信號轉導基因、金屬轉運基因、酶活性相關基因的表達量分析,旨在揭示2,4-EBL參與調控番茄響應Cd脅迫應答的生理機制。本試驗結果表明:(1)生長狀態(tài):Cd脅迫后噴施2,4-EBL的處理組番茄主根長度顯著增加,株高顯著高于單一Cd對照組。浸種處理的番茄幼苗,澆灌Cd處理后與單一Cd處理組相比,浸種處理后澆灌Cd溶液(Td),株高、根長、鮮重均有不同程度的增加。與噴施處理方式相比,在相同生長時間內,浸種處理后的株高、根長、鮮重、干重高于噴施處理2,4-EBL的處理組。(2)生理響應:本試驗測定2,4-EBL處理Cd脅迫下番茄幼苗葉片和根部的4種抗氧化酶活性(SOD、POD、APX和GR)表明,與單一Cd處理組相比,2,4-EBL+Cd處理組的抗氧化酶活性有不同程度的增加;2,4-EBL處理Cd脅迫后的番茄相對于單一Cd對照組的脯氨酸和MDA含量均下降,且葉片和根部都是從3d起差異顯著。番茄幼苗葉片和根部浸種處理后澆灌Cd(Td)溶液的抗氧化酶活性,與單一水對照組(Ta組)相比酶活性略微升高,但是與單一Cd處理組相比顯著降低。說明浸種后受Cd脅迫活性氧增長量不大,植株沒有用過多的過氧化物酶來清除活性氧。從植株氧化損傷程度來看,抗氧化酶活性的變化量,脯氨酸、MDA含量波動趨勢都可以顯示出植株受重金屬Cd脅迫的損傷程度降低。浸種2,4-EBL處理Cd脅迫后番茄幼苗的能力優(yōu)于噴施處理。(3)基因表達:單一Cd處理組與2,4-EBL+Cd組相比,番茄根中BAK1基因、BRI1基因、BES1基因分別在3h、6h、12h增強表達;從6h起,葉片中APX1基因表達量升高,根部(3h~12h)的APX1基因表達量也高于單一Cd處理組。無論是噴施2,4-EBL處理Cd脅迫的番茄幼苗還是浸種處理后受Cd脅迫,番茄葉片中IRT1基因表達量均呈現上升趨勢,而根中只有浸種的處理表達上調。(4)番茄BAK1基因編碼區(qū)全長序列的克隆及生物信息學分析:本實驗以番茄為材料,利用同源克隆方法,得到1個油菜素內酯信號轉導基因的cDNA全長序列。測序結果與GenBank的參照序列同源性達99%,該基因序列長度為1671bp,編碼218個氨基酸。結果表明該蛋白質二級結構主要由42.20%的α螺旋、11.01%的β折疊以及28.44%無規(guī)則卷曲共同構成,此外還有少量的延伸鏈(18.35%)。番茄與絨毛狀煙草、煙草、馬鈴薯、潘利娜番茄互為并系,支持率僅為50%。(5)番茄BES1基因編碼區(qū)全長序列的克隆及生物信息學分析:利用同源克隆方法對番茄基因進行克隆,克隆得到1個EBL信號轉導基因BES1的cDNA全長序列,其序列長度為1218 bp,編碼325個氨基酸。對番茄BES1蛋白進行二級結構預測,結果表明該蛋白質二級結構主要由18.15%的α螺旋、8.92%的β折疊以及60.62%的無規(guī)則卷曲共同構成,此外還有少量的延伸鏈(12.31%)。番茄和潘利娜番茄與馬鈴薯具有較高的同源關系。
【學位授予單位】：哈爾濱師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X173;S641.2
【圖文】：

哈爾濱師范大學碩士學位論文當細胞中甾類分子濃度低時，BAK1 與 BRI1 的協同作用受到 BKI1 和 BRI1二聚體相互作用的抑制，進一步抑制 BRI1 的功能。然后 BIN2 開始響應調控時 BES1 和 BZR1 受磷酸酶解。BZR1 基因磷酸酶解后，BZR1 磷酸蛋白酶降低R 基因合成受機制，提高了 BR 基因表達量[35]。當甾類分子的濃度持續(xù)增加后R 與 BRI1 基因相結合，促進 BAK1 和 BRI1 的作用方式，磷酸酶被蛋白酶激活終分離了 BRI1 與 BKI1 基因。成功激活后的 BAK1 和 BRI1 可能會間接抑制 BI性或激活 BSU1，以及同時存在兩種情況，進而導致 BZR1 和 BES1 基因的去化[36]，降低 BR 表達水平；非磷酸化狀態(tài)的 BES1 也會在積累于核中，結合 成基因的啟動子，進而在核中激活 BR 誘導基因的表達。

cDNA 1μlTotal 25 μl后，取產物 3 μl 用 1% 瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成 基因 cDNA 序列克隆泳中的 DNA 片段回收AK1 基因的 PCR 產物進行膠回收。利用瓊脂糖凝膠 D皓生物技術有限公司）對擴增產物進行回收。具體回 DNA 片段與克隆載體的連接桿菌細胞 DH5α 的轉化用的克隆載體是康為世紀公司生產的 pUC-T Quick快速連接試劑盒）（含載體，連接酶），載體的大小和克

2μl0.5 μl0.5 μl10 μl浴中反應 4 h 后，進行瓊脂糖凝化樹的構建inder 程序分析蛋白質的開放讀n.org/）在線蛋白質序列和結構 BAK1 蛋白序列均來自于 NCBINAMAN 對序列進行多重比對，茄 BAK1 基因編碼區(qū)全長

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