【摘要】：在蕓薹屬作物中,花色是一個(gè)重要的性狀,其變異來(lái)源廣且種類(lèi)繁多�；ㄉ哂羞z傳穩(wěn)定和易于觀察的特點(diǎn),在通過(guò)去除雜株提高雜交種純度和檢測(cè)種間性狀轉(zhuǎn)移技術(shù)的可靠性等生產(chǎn)實(shí)踐方面發(fā)揮重要的作用,同時(shí)還可以影響授粉者的行為。蕓薹屬作物花色的觀賞價(jià)值很高,可作為旅游資源,對(duì)促進(jìn)區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展上潛力巨大。因此開(kāi)展大白菜橙花和白花基因的克隆及其形成的分子機(jī)理研究,將為大白菜花色育種和解析大白菜花色變異機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究以大白菜黃花自交系92S105、橙花自交系94C9和白花自交系15S1040及其雜交獲得的F_1代、F_1植株回交或自交獲得的BC_1F_1、BC_1F_2和F_2群體為研究材料,對(duì)橙花和白花基因進(jìn)行精細(xì)定位,鑒定克隆了控制花色的候選基因,并分析了候選基因序列差異及其表達(dá)模式,同時(shí)對(duì)黃花、橙花和白花花瓣類(lèi)胡蘿卜素成分及類(lèi)胡蘿卜素相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了分析。本研究取得了如下主要的結(jié)果:1.遺傳分析表明大白菜橙花性狀由單隱性基因(Brof)控制。利用橙花自交系94C9和黃花自交系92S105為親本構(gòu)建的BC_1F_1和BC_1F_2定位群體,將橙花基因定位于A09染色體41.5 kb區(qū)間內(nèi),兩側(cè)標(biāo)記為InDel409和dCAPS425,遺傳距離為0.4 cM,區(qū)間包含6個(gè)注釋基因。2.利用設(shè)計(jì)的定位區(qū)間內(nèi)注釋基因特異性引物克隆其cDNA序列,結(jié)果只成功克隆了Bra037124和Bra037125基因cDNA序列。Bra037124和Bra037125基因分別編碼包含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子和包含SEC-C元件和OTU結(jié)構(gòu)域半胱氨酸蛋白酶家族蛋白。橙花自交系(94C9、15S1014和94B6)和黃花自交系(92S105和09Q5)中Bra037124和Bra037125基因的推導(dǎo)氨基酸序列分析表明,在Bra037124基因編碼區(qū)內(nèi),黃花和橙花自交系間2個(gè)SNP突變導(dǎo)致氨基酸殘基的改變;在Bra037125基因編碼區(qū)內(nèi),黃花和橙花自交系間22個(gè)SNP突變和1個(gè)序列插入導(dǎo)致7個(gè)氨基酸殘基的改變和1個(gè)氨基酸殘基的插入。對(duì)92S105和94C9花瓣中定位區(qū)間內(nèi)注釋基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示Bra037124和Bra037125基因在92S105和94C9花瓣中表達(dá)水平較高且有顯著差異,但其他基因表達(dá)水平較低甚至檢測(cè)不到,這與克隆cDNA序列結(jié)果一致。Bra037124和Bra037125基因組織特異性表達(dá)分析顯示,Bra037124基因在所有組織中均有表達(dá),但在兩親本根中的表達(dá)差異倍數(shù)顯著高于其他組織,且Bra037125基因在花瓣中的表達(dá)水平高于其他組織(根、莖和莖生葉)。根據(jù)上述結(jié)果和目前關(guān)于Bra037124同源基因功能的研究及Bra037125基因編碼未知功能蛋白,綜合分析認(rèn)為Bra037125基因最可能為橙花性狀候選基因。根據(jù)橙花和黃花自交系Bra037125基因DNA序列差異,開(kāi)發(fā)了InDel601共分離標(biāo)記。3.遺傳分析表明大白菜白花性狀由兩對(duì)隱性基因控制,并將兩個(gè)基因命名為Brwf1和Brwf2。利用白花自交系15S1040和黃花自交系92S105為親本構(gòu)建的F_2群體,將Brwf1基因定位于A01染色體49.6 kb區(qū)間內(nèi),兩側(cè)標(biāo)記為S361和S363,遺傳距離為0.11 cM,區(qū)間內(nèi)有9個(gè)注釋基因。將Brwf2基因定位于A09染色體59.3 kb區(qū)間內(nèi),兩側(cè)標(biāo)記為S82和S83,遺傳距離為0.08 cM,區(qū)間內(nèi)包含12個(gè)注釋基因。根據(jù)Brwf1和Brwf2定位區(qū)間內(nèi)基因的注釋信息,選擇編碼質(zhì)體脂類(lèi)相關(guān)蛋白(BrPAP)和類(lèi)胡蘿卜素異構(gòu)酶(BrCRTISO)的基因Bra013602和Bra031539作為白花候選基因。4.通過(guò)比較白花自交系(15S1040、15S1001和17S690)和黃花自交系(92S105和09Q5)內(nèi)Bra013602和Bra031539基因的推導(dǎo)氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)在Bra013602基因編碼區(qū)內(nèi),黃花和白花自交系間1個(gè)SNP突變導(dǎo)致氨基酸殘基的改變,且該位點(diǎn)位于BrPAP保守結(jié)構(gòu)域內(nèi);在Bra031539基因編碼區(qū)內(nèi),黃花和白花自交系間1個(gè)SNP突變導(dǎo)致氨基酸殘基的改變,且該位點(diǎn)位于BrCRTISO保守結(jié)構(gòu)域內(nèi),同時(shí)3’末端大片段(943 bp)的插入導(dǎo)致了15個(gè)氨基酸殘基的突變,1個(gè)氨基酸殘基的插入和3個(gè)氨基酸殘基的缺失。利用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)了Bra013602和Bra031539基因在92S105和15S1040不同組織(根、莖、莖生葉和花瓣)中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示相比于其他組織,Bra013602和Bra031539基因在花瓣中均有較高的表達(dá)水平且Bra013602基因在92S105花瓣中的表達(dá)水平高于在15S1040中,但Bra031539基因的表達(dá)水平在兩親本間沒(méi)有顯著差異。通過(guò)透射電鏡對(duì)黃花和白花花瓣內(nèi)有色體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示黃花花瓣內(nèi)有色體發(fā)育正常且質(zhì)體小球(PG)數(shù)量較多,但白花花瓣內(nèi)有色體發(fā)育不良且PG數(shù)量很少。這些結(jié)果證實(shí)了Bra013602和Bra031539為白花候選基因,同時(shí)分別獲得了這兩個(gè)基因的共分離標(biāo)記W543和W61。5.通過(guò)高效液相色譜(HPLC)對(duì)大白菜黃花、橙花和白花花瓣中類(lèi)胡蘿卜素成分進(jìn)行分析。結(jié)果顯示黃花、橙花和白花花瓣中類(lèi)胡蘿卜素總含量分別為211.69±21.70μg/g、457.33±25.60μg/g和10.49±1.21μg/g,且黃花和白花花瓣主要積累紫黃質(zhì)和葉黃素,但它們的類(lèi)胡蘿卜素總含量差異很大,可能導(dǎo)致了黃花和白花花色的差異;但橙花花瓣主要積累葉黃素和β-胡蘿卜素,且橙花的形成可能主要由于β-胡蘿卜素的積累。6.檢測(cè)了類(lèi)胡蘿卜素代謝相關(guān)基因在黃花、橙花和白花花瓣中的表達(dá)水平。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析表明,相比于黃花花瓣中,在橙花花瓣中β-胡蘿卜素羥化酶基因(CHYB)和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因(ZEP)表達(dá)水平均降低,可能是導(dǎo)致β-胡蘿卜素積累的原因。在黃花和白花花瓣中,qRT-PCR結(jié)果顯示,大多數(shù)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑基因在白花花瓣中表達(dá)水平低于在黃花中,可能導(dǎo)致了白花花瓣中類(lèi)胡蘿卜含量的降低。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S634.1
【圖文】：

3圖 1-1 植物類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑（Tan et al. 2003；Chiou et al. 2010；Walter and Strack 2011）PSY，八氫番茄紅素合成酶；PDS，八氫番茄紅素脫氫酶；Z-ISO，ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶；ZDS，ζ-胡蘿卜素脫氫酶；CRTISO，類(lèi)胡蘿卜素異構(gòu)酶；LCYE，番茄紅素 -環(huán)化酶；LCYB，番茄紅素 β-環(huán)化酶；CHYB，β-胡蘿卜素羥化酶；CYP97，細(xì)胞色素 P450 型單加氧酶 97；ZEP，玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶；NXS，新黃質(zhì)合成酶；VDE，紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶；CCD，類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶；NCED，9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶Fig. 1-1 Carotenoid metabolic pathway in plant（Tan et al. 2003; Chiou et al. 2010; Walter andStrack 2011）PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase; Z-ISO, ζ-carotene isomerase; ZDS, ζ-Carotene desaturase;CRTISO, carotenoid isomerase; LCYE, lycopene -cyclase; LCYB, lycopene β-cyclase; CHYB, β-carotene hydroxylase;CYP97, cytochrome P450-type monooxygenase 97; ZEP, zeaxanthin epoxidase; NXS, neoxanthin synthase; VDE,violaxanthin de-epoxidase; CCD, carotenoid cleavage dioxygenases; NCED, nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenases

2群體。其他六個(gè)黃花和橙花自交系用于共分離標(biāo)記的驗(yàn)證。圖2-1 試驗(yàn)中所使用的兩個(gè)大白菜親本花色a，94C9；b，92S105Fig. 2-1 Flower colors of the two parental lines used in this studya, 94C9; b, 92S105兩親本和 BC1F1群體單株于 2015 年，兩親本、六個(gè)黃花和橙花自交系及 BC1F2群體單株于 2018 年種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)蔬菜試驗(yàn)基地，自然春化，管理?xiàng)l件相同。在盛花期，每個(gè)單株花色的確定需要經(jīng)過(guò)兩次觀察，間隔 8 天且每株觀察至少 10朵完全開(kāi)發(fā)的花。2.1.2 DNA 和 RNA 提取，cDNA 合成和 PCR 擴(kuò)增采用改良的 CTAB 法提取新鮮葉片基因組 DNA，參照 Porebski 等（1997）報(bào)道的方法

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文連鎖圖譜，同時(shí)將橙花基因限定于 A09 染色體 InDel181 和 InDel182 標(biāo)記之間，遺傳距離為 8.7 cM，對(duì)應(yīng)的物理距離為 1.6 Mb（圖 2-2a）。另外，利用 InDel181 和 InDel182檢測(cè)黃花和橙花 DNA 混池，進(jìn)一步驗(yàn)證了其與橙花基因連鎖（圖 2-3）。2.2.3 橙花基因的精細(xì)定位為了對(duì)橙花基因進(jìn)行精細(xì)定位，利用雙親基因組在初定位區(qū)間內(nèi)的 DNA 變異開(kāi)發(fā)了 74 個(gè) InDel 標(biāo)記，其中 43 個(gè)在親本間具有多態(tài)性（附錄Ⅴ）。利用 InDel181 和InDel182 標(biāo)記檢測(cè) BC1F1群體 478 個(gè)單株，共發(fā)現(xiàn) 50 個(gè)交換單株，其中 InDel181 側(cè)24 個(gè)，InDel182 側(cè) 26 個(gè)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2771120