【摘要】：黃瓜作為我國設(shè)施栽培中的主要蔬菜作物,其在設(shè)施生產(chǎn)中遭遇冬季低溫是限制其產(chǎn)量的重要因素。植物G蛋白是由三個(gè)不同亞基組成的異源三聚體,它在質(zhì)膜上能夠發(fā)揮傳遞信號的功能,參與植物對脅迫的響應(yīng)。GPA1的特性及相關(guān)功能在擬南芥和水稻中均已研究,但是黃瓜中G蛋白α亞基的特性及相關(guān)功能,是否能夠通過與低溫調(diào)控有關(guān)的蛋白互作共同調(diào)控低溫脅迫下不依賴于ABA信號通路的分子機(jī)制尚缺乏相關(guān)研究。針對這一現(xiàn)狀,本研究克隆得到了黃瓜中編碼G蛋白α亞基的基因CsGPA1,通過亞細(xì)胞定位、免疫組織化學(xué)定位及檢測CsGPA1的表達(dá)模式,分析其生物功能,初步探明了其在黃瓜低溫脅迫下的生理分子機(jī)制,解析了其在黃瓜低溫脅迫中的作用,本文的主要研究結(jié)果如下:(1)編碼G蛋白α亞基的基因在黃瓜中僅有一個(gè)CsGPA1,是單拷貝基因。qRT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果表明,在各器官組織中均能檢測到CsGPA1基因的表達(dá),其在根中的表達(dá)量相對最高,其次為幼葉,而CsGPA1在其它的器官組織,如成熟葉、莖、雌花、雄花和果實(shí)中轉(zhuǎn)錄水平均較低。(2)免疫組織化學(xué)定位結(jié)果表明,CsGPA1蛋白在黃瓜的葉柄、莖和根尖中均有表達(dá)。主要存在于莖的內(nèi)外韌皮部和根尖的分生組織中,尤其是根尖的分生組織表皮細(xì)胞中。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明CsGPA1是定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜蛋白。(3)通過測定野生型(WT)、過表達(dá)CsGPA1(OE)株系和干擾(RNAi)株系中種子萌發(fā)率和幼苗的形態(tài)指標(biāo)得出:黑暗條件下,過表達(dá)CsGPA1可以促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)和早期幼苗(下胚軸長度、莖粗、表面積、投影面積、根體積和根長)的生長;反之,干擾CsGPA1則抑制了幼苗的生長。結(jié)果表明:黑暗條件下,CsGPA1可能通過促進(jìn)過表達(dá)株系細(xì)胞伸長進(jìn)而促進(jìn)早期幼苗的生長。進(jìn)一步測定WT、CsGPA1-OE和RNAi株系幼苗內(nèi)源激素(水楊酸)的含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和外施水楊酸(SA)分析得出,黑暗條件下CsGPA1可能通過調(diào)控幼苗內(nèi)SA合成關(guān)鍵基因CsCBP60g,CsEDS1,CsSID2(子葉中)和CsSR1基因(下胚軸以及根中)的相對表達(dá)量影響黃瓜幼苗內(nèi)源SA的合成�？傊�,CsGPA1正調(diào)節(jié)種子萌發(fā),并參與黑暗條件下黃瓜早期幼苗的生長。(4)低溫(6℃)處理60h后發(fā)現(xiàn),與野生型相比,CsGPA1-RNAi株系植株葉片出現(xiàn)更加明顯的失水及萎蔫表型,說明干擾(RNAi)株系中,低表達(dá)水平的CsGPA1能夠減弱植株自身對低溫的抵抗能力。與野生型相比,低溫脅迫下,干擾(RNAi)株系葉片中Cs WCO413PM,CsICE1,CsCBF1,CsCBF3和CsRD-29基因的相對表達(dá)量下調(diào),CsHOS1基因的相對表達(dá)量上調(diào);并降低了脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白的含量和抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性;提高了相對電導(dǎo)率(REC)和丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果表明:CsGPA1-RNAi株系耐低溫能力降低。同時(shí),應(yīng)用分裂泛素酵母雙雜交系統(tǒng)建立黃瓜葉片cDNA表達(dá)文庫,初步篩選出11個(gè)可能與CsGPA1的互作蛋白;并進(jìn)一步利用GST pull down技術(shù)證明CsWCOR413PM和CsGPA1相互作用,可能共同參與低溫脅迫的響應(yīng)。黃瓜G蛋白α亞基(CsGPA1)主要定位于質(zhì)膜、莖的內(nèi)外韌皮部和根尖的分生組織中,尤其是根尖的分生組織表皮細(xì)胞中;CsGPA1正調(diào)節(jié)黃瓜種子萌發(fā),并參與黑暗條件下早期幼苗(子葉、下胚軸和根)的生長;CsGPA1參與了黃瓜幼苗低溫脅迫的響應(yīng);分裂泛素酵母雙雜和GST pull down試驗(yàn)證明CsWCOR413PM和CsGPA1存在互作。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S642.2
【圖文】：

胞質(zhì)的擴(kuò)散作用把這種信號傳遞到質(zhì)膜內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)或觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)逡逑一連串的生理生化反應(yīng)。ＧＴＰ／ＧＤＰ的轉(zhuǎn)化是Ｇ蛋白活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵（Ｗａｎｇ扣ａ／．，逡逑２００］）。典型Ｇ蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如圖１－１所示（Ｕｒａｎｏｅ／ｆｌ／．，２０１３）。Ｇ蛋白作逡逑為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子開關(guān)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑持續(xù)時(shí)間的長短取決于Ｇｏｔ亞基處于ＧＴＰ逡逑結(jié)合狀態(tài)的時(shí)間長短。ＧＰＣＲ是一類膜蛋白，由３５０－５００個(gè)氨基酸組成，其分子量為逡逑４０－５０邋ｋＤａ左右，具有七個(gè)跨膜的ａ－螺旋結(jié)構(gòu)域，其Ｎ端的天冬酰胺殘基和糖基化的氨逡逑基酸序列位于細(xì)胞外，可以將信號從胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜中；而磷酸化的Ｃ端氨基酸序逡逑列則位于細(xì)胞內(nèi)。研究結(jié)果證明，擬南芥中的ＧＣＲ１參與了細(xì)胞分裂素、ＡＢＡ等多種逡逑激素信號途徑（Ｐａｎｄｅｙｄａ／．，邋２００４；邋Ｌｉｕ邋ｅ？ａ／．，邋２０１２）。作為Ｇ蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)逡逑調(diào)控因子，Ｇ蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ邋ｏｆ邋Ｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＲＧＳ），逡逑能夠促進(jìn)ＧＴＰａｓｅ的水解活性

ｌｕｃｂｃｎ邋ｏｌ邋Ｅｘａｒｔｔｓｔｏｉ＾ｂ＞邋0？ｎｔｓ逡逑Ｉ邋一少Ｔ＾ｒ，）邋－Q\0逡逑圖１－２植物在冷害脅迫條件下信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要過程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｉｎｔｅｒｐｌａｙ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｉｎ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ逡逑ｔｏ邋ｃｏｌｄ邋ｓｔｒｅｓｓ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋（Ｈｕａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２）逡逑７逡逑

＿００４１４１３００）邋Ｇ蛋白ａ亞基基因（ＣｓＧｉＭｉ）序逡逑列和所用過表達(dá)載體（ｐＢＩ１２１）的序列信息（圖２－３）選擇合適的酶切位點(diǎn)Ｉ和逡逑＾２＾１，并根據(jù)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物：逡逑正向擴(kuò)增引物：Ｆ邋５，－邋ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＡＡ－３，逡逑反向擴(kuò)增引物：Ｆ邋５，－邋ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡ－３，逡逑ＲＢ邐Ｎｐｔｎ邋（Ｋａｎ）邐ＣａＭＶ邋３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ邐ＧＰＡ１邐ＮＯＳ－ｔｅｒ邋ＬＢ逡逑ＮＯＳ－ｐｒｏ邐ＮＯＳ－ｔｅｒ邐Ｘｂａ邋Ｉ邐￥ｍａ邋Ｉ逡逑圖２－２過表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑然后使用獲得的ｃＤＮＡ單鏈進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：邐逡逑試劑名稱邐體積逡逑ｄｄＨ２０邐３３邐＼ｉ＼逡逑ｃＤＮＡ邐１邐｜ｉｌ逡逑ｌＯｘＰＣＲ邋ｂｕｆｆｅｒ邐５邐ｎｌ逡逑ｄＮＴＰｓ邋（２．５邋ｍｍｏｌ）邐４邐ｐｉ逡逑ＣｓＧＰＡｌ－ＯＥ－Ｆ邋（１０｜ｉＭ）邐２．５邐＾１逡逑ＣｓＧＰＡｌ－ＯＥ－Ｒ邋（ｌＯｐＭ）邐２．５邐＾１逡逑Ｔａｑ邋酶（５邋Ｕ／ｐｌ）邐１邐ｐｉ逡逑邐總體積邐５０ｊｉｌ邐逡逑體系配好后混勻

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬鮮歌;賀軍民;;異三聚體G蛋白在UV-B誘導(dǎo)擬南芥氣孔關(guān)閉中的作用[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年05期

2 計(jì)淑霞;戴紹軍;劉煒;;植物應(yīng)答低溫脅迫機(jī)制的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2010年10期

3 劉民;;水稻低溫冷害分析及研究進(jìn)展[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年04期

4 史冬燕;;低溫脅迫對擬南芥G蛋白突變體SOD、POD酶活性和丙二醛含量的影響[J];貴州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年02期

5 王連敏,王立志,王春艷,李忠杰,劉功,郭建平,關(guān)雙紅;花期低溫對寒地水稻穎花結(jié)實(shí)的影響[J];自然災(zāi)害學(xué)報(bào);2004年02期

6 高志杰,王國華;黃瓜對低溫反應(yīng)的研究進(jìn)展[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2002年S1期

7 郭毅,馬力耕,張璐,孫大業(yè);異三聚體G蛋白在細(xì)胞外鈣調(diào)素調(diào)控rbcS基因表達(dá)中的作用[J];科學(xué)通報(bào);2000年20期

8 馬力耕,孫大業(yè);植物細(xì)胞多肽第一信使[J];科學(xué)通報(bào);2000年18期

9 于賢昌，邢禹賢，馬紅，魏珉;不同砧木與接穗對黃瓜嫁接苗抗冷性的影響[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);1998年02期

10 于賢昌,邢禹賢,馬紅,魏珉;黃瓜嫁接苗抗冷特性研究[J];園藝學(xué)報(bào);1997年04期

本文編號：2759420