發(fā)布時(shí)間：2020-07-17 00:12

【摘要】：GRPs(Glycine-rich proteins,富含甘氨酸蛋白),一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且富含甘氨酸的高度重復(fù)序列組成的一個(gè)大家族蛋白,其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物防御、非生物脅迫響應(yīng)等過程中起著重要作用。課題組前期發(fā)現(xiàn)一個(gè)在pol型細(xì)胞質(zhì)雄性不育和可育植株花蕾中存在表達(dá)差異的基因BrGRP1,且在不育花蕾中表達(dá)量較高。本試驗(yàn)主要通過cDNA文庫(kù)構(gòu)建和篩選、BrGRP1過表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植株抗逆性鑒定等研究,初步揭示該基因的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下:(1)以大白菜不育系16C14花蕾為試驗(yàn)材料,采用SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技術(shù)合成 cDNA,利用 DSN(duplex-specific nuclease)對(duì)所得cDNA進(jìn)行均一化處理,之后與pDONRTM/Zeo載體重組并轉(zhuǎn)化DH10B大腸桿菌菌株,構(gòu)建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè),文庫(kù)滴度為3.2×106 cfu/mL,庫(kù)容量約為1.28×10 cfu,重組率97%,插入片段平均大小1.2kb左右。隨機(jī)挑選100個(gè)陽性菌斑進(jìn)行測(cè)序,冗余度僅為3.7%。(2)以文庫(kù)質(zhì)粒為模板,利用特異引物GRP-F/R成功克隆到BrGRP1基因cDNA序列。序列分析表明BrGRP1基因完整的ORF(Open Reading Frame,開放閱讀框)為804 bp,編碼267個(gè)氨基酸,分子量為29.7 kDa,等電點(diǎn)為7.3;其編碼的BrGRP1蛋白為非跨膜蛋白,也不是分泌蛋白。與白菜基因組預(yù)測(cè)基因Bra004066序列相似性為93%,擬南芥At1G6787 基因的相似性為65%。(3)利用無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建過表達(dá)載體Cam35S-BrGRP1,進(jìn)一步進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。通過抗生素抗性篩選和PCR鑒定共獲得7個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)基因純系,從中隨機(jī)選取了三個(gè)轉(zhuǎn)基因T3代純系(GRP1,GRP4和GRP5)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥在表型上沒有發(fā)生變化;qRT-PCR分析表明BrGRP1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中高效表達(dá)。逆境響應(yīng)研究表明:0.3μmmol/LABA、100 mmol/LNaCl處理可抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明該BrGRP1基因可能參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及NaCl脅迫響應(yīng)過程。
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S634.1
【圖文】：

２．３．１總ＲＮＡ提取及質(zhì)量檢測(cè)逡逑以／？0／型大白菜雄性不育系１６Ｃ１４不育花蕾為材料，提取總ＲＮＡ，經(jīng)電泳檢測(cè)，逡逑有２８Ｓ和１８Ｓ兩條帶，且條帶完整，沒有彌散，亮度之比約為２：１邋（圖２－１）；同時(shí)用核酸逡逑儀測(cè)定ＯＤ２６０／２８０為２．０３和２．０５，說明所提取的總ＲＮＡ的質(zhì)量較好，符合文庫(kù)構(gòu)建的要逡逑求。逡逑＾—邋２ＳＳ邋ｒＲＮ＇Ａ逡逑＾ＩＳＳ逡逑圖２－１大白菜雄性不育系花蕾總ＲＮＡ電泳圖逡逑１、２均代表總ＲＮＡ，二次重復(fù)。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ＣＭＳ邋ｆｌｏｗｅｒｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｃａｂｂａｇｅ逡逑１邋ｎ邋２，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑－１２－逡逑

２．３．１總ＲＮＡ提取及質(zhì)量檢測(cè)逡逑以／？0／型大白菜雄性不育系１６Ｃ１４不育花蕾為材料，提取總ＲＮＡ，經(jīng)電泳檢測(cè)，逡逑有２８Ｓ和１８Ｓ兩條帶，且條帶完整，沒有彌散，亮度之比約為２：１邋（圖２－１）；同時(shí)用核酸逡逑儀測(cè)定ＯＤ２６０／２８０為２．０３和２．０５，說明所提取的總ＲＮＡ的質(zhì)量較好，符合文庫(kù)構(gòu)建的要逡逑求。逡逑＾—邋２ＳＳ邋ｒＲＮ＇Ａ逡逑＾ＩＳＳ逡逑圖２－１大白菜雄性不育系花蕾總ＲＮＡ電泳圖逡逑１、２均代表總ＲＮＡ，二次重復(fù)。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ＣＭＳ邋ｆｌｏｗｅｒｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｃａｂｂａｇｅ逡逑１邋ｎ邋２，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑－１２－逡逑

邐＾＾ａａｌ邋（５５４３）逡逑Ｘｈｏｌ邋（８９０６）ＬＢ邋ＡｐａＵ（６９８８？逡逑圖３－１邋Ｃａｍ３５Ｓ－ＢｒＧＲＰ］過表達(dá)載體的構(gòu)建逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｔ＇Ｃａｍ３５Ｓ－ＢｒＧＲＰｌ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑②轉(zhuǎn)化液的配置逡逑配制１／２邋ＭＳ轉(zhuǎn)化緩沖液，所包含成分及用量具體見表３－８：逡逑表３－８邋１／２邋ＭＳ轉(zhuǎn)化緩沖液體系逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－８邋Ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋１／２邋ＭＳ邋ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ邋ｂｕｆｆｅｒ逡逑成分邐使ＨＪＭ逡逑Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ邐Ａｍｏｕｎｔ逡逑ＭＳ邋干粉邐２．３５ｇ逡逑蔗糖邐５０．０ｇ逡逑６－ＢＡ（ｌｍｇ／ｍＬ）邐１０．０邋｜ｊ．Ｌ逡逑Ｓｉｌｗｅｔｔ－７７邐４００邋｜ｉＬ逡逑乙酰ｒ香酮邐１０（ＨｉＬ逡逑邐蒸餾水定容至邐ＩＬ邐逡逑將檢測(cè)陽性的農(nóng)桿菌陽性菌液以１：１２５稀釋于２５０邋ｍｌ大瓶培養(yǎng)基中，２８°Ｃ，邋２００邋ｒｐｍ逡逑培養(yǎng)至00６00約為0．８；之后將菌液４１＾，５邋００0１＾１１１離心５邋１１１丨１１，收集菌體；最后，將逡逑菌體重懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化緩沖液中，至終濃度0Ｄ６（Ｗ值為０．６－０．８，并用ＮａＯＨ溶逡逑液調(diào)ｐＨ至５．８

【相似文獻(xiàn)】

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1 李真真;大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2758700