發(fā)布時(shí)間：2020-06-30 19:44

【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium)是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一,觀賞、經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。蚜蟲是嚴(yán)重為害菊花的最主要害蟲,整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)危害均十分嚴(yán)重,且化學(xué)防治困難。蚜蟲作為刺吸式昆蟲,主要取食韌皮部汁液,消耗植株養(yǎng)分,同時(shí)還傳播病毒病、誘發(fā)霉污病等,嚴(yán)重影響菊花產(chǎn)量與觀賞品質(zhì)。蚜蟲為害已成為限制我國(guó)菊花產(chǎn)業(yè)化健康發(fā)展的主要瓶頸之一。獨(dú)腳金內(nèi)酯是一類新型的植物激素,調(diào)控植物諸多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,如抑制植株地上部分枝,促進(jìn)不定根形成、根毛伸長(zhǎng),莖的次生生長(zhǎng)和節(jié)間伸長(zhǎng)等。近期有研究發(fā)現(xiàn),獨(dú)腳金內(nèi)酯可與多種防御激素(病蟲生物脅迫、非生物脅迫)交互對(duì)話,從而調(diào)控?cái)M南芥的抗旱性、耐鹽性及抗病性。然而,關(guān)于獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控植物抗蚜性方面的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討?yīng)毮_金內(nèi)酯是否調(diào)控菊花抗蚜性?其調(diào)控抗蚜性的具體機(jī)制是什么?以期為菊花蚜蟲防治及減藥栽培提供科學(xué)依據(jù),亦可揭示獨(dú)腳金內(nèi)酯的新生物學(xué)功能。本研究的主要內(nèi)容與結(jié)論如下:1.通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,結(jié)合RACE-PCR技術(shù),從切花菊'神馬'中克隆得到了獨(dú)腳金內(nèi)酯合成基因CmCCD8。通過(guò)與其他物種中同源CCD8氨基酸比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),菊花CmCCD8和矮牽牛PhCCD8/DAD1的同源性最高。組織表達(dá)模式分析顯示,CmCCD8基因在根中的表達(dá)量最高,其次是莖,在葉片中表達(dá)量最低,其受獨(dú)腳金內(nèi)酯類似物GR24和蚜蟲誘導(dǎo)表達(dá)。構(gòu)建了 pBIG-CmCCD8超表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得了 CmCCD8超表達(dá)轉(zhuǎn)基因菊花OX-1、OX-2。CmCCD8超表達(dá)株系內(nèi)源SL的含量測(cè)定顯示,發(fā)現(xiàn)SL類似物361在OX-1、OX-2中的含量高于野生型WT,而SL類似物363、371含量低于WT,并且呈現(xiàn)顯著差異。表明CmCCD8具有編碼獨(dú)腳金內(nèi)酯合成酶催化獨(dú)腳金內(nèi)酯合成的功能。2.對(duì)外源GR24處理及CmCCD8過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OX-1和OX-2進(jìn)行了抗蚜性鑒定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的蟲口密度顯著高于野生型。刺探電位圖譜(EPG)顯示蚜蟲取食轉(zhuǎn)基因株系的第一次細(xì)胞穿刺時(shí)間(Pd)、非刺吸階段的總時(shí)間(np)和完成第一次成功刺探的時(shí)間(C)均比野生型中的時(shí)間短,且在轉(zhuǎn)基因株系葉片韌皮部的取食時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生型。葉片表皮微觀形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)分析表明,轉(zhuǎn)基因株系抗蚜性的減弱與葉片表面表皮毛密度較低、葉片厚度、柵欄組織厚度及下表皮厚度減少有關(guān)。葉片中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量較野生型低,從而對(duì)蚜蟲的機(jī)械防御減弱。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因株系中木質(zhì)素合成路徑Cm4CL2、CmCCR2和CmCAD6基因、纖維素合成路徑CmCesA3和CmCesA8基因、調(diào)控木質(zhì)素合成的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子CmMYB19、CmMYB46和CmNAC2基因的表達(dá)均顯著低于野生型植株。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)野生型'神馬'及轉(zhuǎn)基因株系葉片初生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系葉片中丙酮醇、十六碳烯酸、糞甾烷酸、二甲基組氨酸、2,4-二氨基丁酸及京都啡肽等初生代謝物的含量明顯低于野生型。表明獨(dú)腳金內(nèi)酯可調(diào)控菊花的機(jī)械防御及減少初生代謝物中的毒殺成分從而調(diào)控菊花的抗蚜性。3.外源GR24處理及轉(zhuǎn)基因植株的蚜蟲取食趨避性分析發(fā)現(xiàn),GR24處理下及轉(zhuǎn)基因植株對(duì)蚜蟲的趨避性減弱。葉片揮發(fā)物成分分析顯示,轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比,有14種萜烯含量發(fā)生變化,其中驅(qū)避性萜烯(E)-β-Famesene和β-Caryophyllene在轉(zhuǎn)基因植株中的含量顯著下降。在野生型和轉(zhuǎn)基因株系中,外源(E)-β-Famesene和β-Caryophyllene增加了植株對(duì)蚜蟲的驅(qū)避性。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),蚜蟲驅(qū)避性萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene合成基因CmTPS1和CmTPS2在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量較野生型顯著下調(diào)。GR24處理下、CmCCD8超表達(dá)植株中CmNCED3a的表達(dá)下調(diào),且轉(zhuǎn)基因株系中內(nèi)源ABA含量顯著低于野生型植株;外源噴施55 μM、110μM ABA能夠增強(qiáng)對(duì)蚜蟲的驅(qū)避性,處理24h后,CmTPS1、CmTPS2的表達(dá)水平較對(duì)照低。GR24處理下、CmCCD8超表達(dá)株系中SA合成基因CmICS的表達(dá)較對(duì)照顯著上調(diào),CmCCD8超表達(dá)植株中內(nèi)源SA含量高于野生型植株,外源噴施SA可促進(jìn)CmTPS1、CmTPS2基因的表達(dá),增強(qiáng)對(duì)蚜蟲的驅(qū)避性。外源GR24處理下、CmCCD8超表達(dá)株系中JA合成基因CnAOS和CmLOX2的表達(dá)無(wú)顯著變化,且野生型和CmCCD8超表達(dá)植株中JA含量沒(méi)有顯著差異,外源噴施JA可以增加植株對(duì)蚜蟲的驅(qū)避作用,同時(shí)可促進(jìn)CmTPS1、CmTPS2基因的表達(dá)。借助TRV-VIGS沉默菊花腦CnCCD8的沉默株系(TRV2e-CnCCD8-1,2,3,4組)對(duì)蚜蟲的驅(qū)避性強(qiáng)于轉(zhuǎn)TRV2e-GFP空載植株,且沉默株系中CnTPS1和CnTPS2基因的表達(dá)較空載轉(zhuǎn)化株顯著上調(diào),且(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene的含量顯著增加。進(jìn)一步證實(shí)了 SL負(fù)調(diào)控萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene的合成從而降低對(duì)植株對(duì)蚜蟲的驅(qū)避性。綜上,SL介導(dǎo)的對(duì)蚜蟲驅(qū)避性的降低可能是獨(dú)腳金內(nèi)酯(SL)或SL與ABA、SA共同調(diào)控驅(qū)避萜烯合成所致。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.8
【圖文】：

圖１－５植物}P類物質(zhì)代謝７Ｆ意圖（Ｄｕｄａｒｅｖａｅｔａｌ．，２０１３）逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎｐｌａｎｔ邋（Ｄｕｄａｒｅｖａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１３）逡逑第一階段是Ｃ５單位的形成，基本的Ｃ５結(jié)構(gòu)單元異戊烯基二磷酸（ＩＰＰ）合成位逡逑于細(xì)胞質(zhì)中，以乙酰輔酶Ａ為原料的甲羥戊酸（ｍｅｖａｌｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ，ＭＶＡ）途徑；二甲基逡逑二（ＤＭＡＰＰ）ＩＰＰ，，－３－逡逑

ＮＯＳ邋Ｔ逡逑Ｔ－ＤＮＡ邋ｌｅｆｔ邋ｂｏｒｄｅｒ逡逑圖２－１菊花遺傳表達(dá)載體ｐＢＩＧ－Ｃ／ｗＣＣＺ＾構(gòu)建流程逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｔｅｐｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｐＢＩＧ－ＣｗＣＣＤＳ逡逑１．５．２邋ｐＢＩＧ－ＯｗＣＣＺ＾超表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化菊花逡逑采用農(nóng)桿菌葉盤侵染的方法（見(jiàn)附錄十一）進(jìn)行菊花‘神馬’的遺傳轉(zhuǎn)化（Ｃｕｉ邋ｅｔａｌ．，逡逑２００９）。運(yùn)用ＳＤＳ法提取卡那抗性株系的基因組ＤＮＡ邋（見(jiàn)附錄十），采用ＮＰＴＩＩ－Ｆ／ＮＰＴ逡逑ＩＩ－Ｒ引物進(jìn)行ＭＴ／／基因擴(kuò)增（見(jiàn)表２－１）。提取陽(yáng)性株系葉片ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄，采用逡逑表２－丨引物序列逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｐｒｉｍｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑引物邐序列逡逑Ｐｒｉｍｅｒ邐Ｓｅｑｕｅｎｃ邋（５’－３’）逡逑ＮＰＴ邋ＩＩ邋－Ｆ邐ＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣ逡逑ＮＰＴ邋ＩＩ邋－Ｒ邐ＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＧ逡逑ＣｍＣＣＤ８－ＲＴ－Ｆ邐ＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＡ逡逑ＣｍＣＣＤ８－ＲＴ－Ｒ邐ＴＧＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡ逡逑ＣｍＥＦｌａ－Ｆ邐ＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧ逡逑ＣｍＥＦｌａ－Ｒ邐ＣＣ邋ＡＴＴＣＡ邋ＡＧＣＧ邋ＡＣＡＧ邋ＡＣＴＣＡ逡逑２５逡逑

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