【摘要】：黃瓜(Cucumis sativus L.)葫蘆科黃瓜屬植物,廣泛種植于溫帶和熱帶地區(qū),是我國的重要蔬菜作物之一,因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值深受人們喜愛。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)就尤為重要,葉片衰老提前出現(xiàn)將導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降。葉片早衰嚴(yán)重影響黃瓜的光合作用進(jìn)程,有機(jī)物積累能力下降,強(qiáng)制縮短植株發(fā)育周期,加大了營養(yǎng)消耗,進(jìn)而限制了黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì),因此延緩植物衰老,為黃瓜在生產(chǎn)中保產(chǎn)保質(zhì)提供新思路。獨(dú)腳金內(nèi)酯(Strigolactones,SLs)是植物內(nèi)源信號因子,具有抑制植物分枝、調(diào)節(jié)葉片衰老,誘導(dǎo)根寄生性種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)叢枝菌根共生與根部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、緩解非生物脅迫的傷害等多種生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)通過外源施加SLs類似物GR24處理使黃瓜葉片出現(xiàn)早衰表型以及對SLs生物合成關(guān)鍵基因CsCCD7、CsCCD8的功能研究,為進(jìn)一步研究SLs調(diào)節(jié)葉片衰老的分子機(jī)制提供參考。本實(shí)驗(yàn)具體結(jié)果如下:(1)成功克隆黃瓜SLs生物合成關(guān)鍵基因CsCCD7、CsCCD8編碼區(qū)全長分別為1801bp和1621bp,編碼614和545個(gè)氨基酸,經(jīng)生物信息學(xué)分析得出,兩基因均屬于CCDs基因家族;揭示了CsCCD7、CsCCD8及其編碼蛋白的特性,二級結(jié)構(gòu)結(jié)果表明兩種蛋白均含有大量延伸鏈結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲;三級結(jié)構(gòu)結(jié)果表明,CsCCD7蛋白與己知蛋白質(zhì)RPE65的三級結(jié)構(gòu)有較高的同源性;同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,CsCCD7、CsCCD8均與同為葫蘆科植物甜瓜的CmCCD7、CmCCD8同源性最高;基因啟動(dòng)子順勢作用元件的分析顯示,CsCCD7、CsCCD8基因與脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸等多種激素調(diào)節(jié)通路相關(guān)和光相關(guān)順勢作用元件聯(lián)系密切。(2)外源GR24處理可以加速黑暗下離體黃瓜葉片衰老的進(jìn)程,亞顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示,GR24蘸根處理后移至育苗基質(zhì)10d的葉片中葉綠體基粒片層開始出現(xiàn)斷裂分散,在15d時(shí)葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)受損解體,基粒數(shù)量減少。同時(shí)測定相關(guān)衰老生理指標(biāo)顯示葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、凈光合速率都相對于對照組顯著下降,導(dǎo)致光合能力減弱,衰老提前。其中1μM處理效果最為顯著,故選定為最終的處理濃度,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)經(jīng)1μMGR24蘸根處理48h后的黃瓜的根、第5葉中CsCCD7、CsCCD8基因的表達(dá)量相對于對照組顯著上調(diào),其中根部CsCCD7基因最早響應(yīng)GR24,在處理3h時(shí)CsCCD7基因表達(dá)量相對于對照組顯著上調(diào),而根部CsCCD8和第5葉CsCCD7、CsCCD8基因的表達(dá)量在處理24h時(shí)才顯著高于對照組,說明外源GR24處理可能促使黃瓜內(nèi)源性SLs含量升高;同時(shí)測定GR24處理的黃瓜第五葉片中的衰老相關(guān)基因(SGR1、CsPAO、CsPPH)的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)量均顯著上調(diào),其中CsPAO和CsPPH在GR24處理3h時(shí)基因表達(dá)量顯著上調(diào),應(yīng)答速度高于葉片中SGR1的表達(dá)情況,說明GR24處理可能導(dǎo)致葉綠素加速降解,葉片衰老提前出現(xiàn)。(4)黃瓜CsCCD7、CsCCD8基因在側(cè)根、主根、莖、頂芽、新葉、成熟葉、節(jié)間和葉腋處各器官中均有表達(dá),其中側(cè)根和主根的表達(dá)量最大且顯著高于其他器官,同時(shí)葉腋處、頂芽和成熟葉也有較高的表達(dá)量水平。經(jīng)蘸根處理48h后移至土培的黃瓜各組織中CsCCD7、CsCCD8基因表達(dá)量基本隨時(shí)間的推移穩(wěn)步升高,說明GR24處理對黃瓜中各組織的CsCCD7、CsCCD8基因表達(dá)量并非瞬時(shí)應(yīng)答,而是出現(xiàn)持續(xù)升高變化。(5)成功構(gòu)建了CsCCD7、CsCCD8基因的過表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式將其轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,獲得了兩基因過表達(dá)擬南芥5個(gè)陽性株系。經(jīng)過PCR鑒定和表達(dá)量鑒定,轉(zhuǎn)基因結(jié)果可靠。CsCCD7、CsCCD8轉(zhuǎn)基因擬南芥在出芽后20、32天時(shí)相對于對照組WT提早進(jìn)入生殖生長階段,部分葉片并出現(xiàn)黃化表現(xiàn),其中CsCCD7轉(zhuǎn)基因植株衰老程度最大。說明過表達(dá)CsCCD7、CsCCD8基因可以使擬南芥加速衰老。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S642.2
【圖文】：

圖 1-1 葉片衰老的影響因素示意圖[32]Fig.1-1 Schematic diagram of the influencing factors of leaf senescence[32]1.1.3.1 葉片年齡和生長發(fā)育因素葉片衰老主要依賴年齡發(fā)育，在非逆境條件下，葉片發(fā)生自然衰老。Jibran[33]等人根據(jù)模式植物擬南芥葉片衰老的研究結(jié)果整合總結(jié)出一個(gè)模型來解釋葉片衰老的問題。認(rèn)為葉片發(fā)育過程中要經(jīng)歷幼葉，成熟葉，衰老葉三個(gè)階段，在幼

哈爾濱師范大學(xué)畢業(yè)論文葉時(shí)期對衰老誘導(dǎo)信號（環(huán)境因素和激素因素）不敏感，不能誘導(dǎo)葉片出現(xiàn)衰老表征。研究表明，茉莉酸甲酯[33]和乙烯[34]分別處理植物的幼葉和成熟葉，發(fā)現(xiàn)成熟葉比幼葉響應(yīng)機(jī)制更敏感、衰老的速度更快。將這些變化稱為年齡相關(guān)變化（Age-related-changes,ARCs），并定義為嚴(yán)格依賴于年齡和發(fā)育的不可逆轉(zhuǎn)的變化，衰老信號可以量化被看作是積累的，與葉片衰老程度呈正相關(guān)，而不是一時(shí)產(chǎn)生的，受激素和基因的共同控制。根據(jù)模型驗(yàn)證了即使是對植物有利的環(huán)境條件，也會(huì)發(fā)生自然衰老的變化（圖 1-2）。1.1.3.2 植物激素途徑參與葉片衰老植物激素對葉片衰老的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，葉片衰老與許多激素的信號通路都有密切聯(lián)系，不同激素之間也存在拮抗和協(xié)同作用，貫穿整個(gè)衰老進(jìn)程的始末[33.35]。激素在葉片衰老中起關(guān)鍵作用一直是被人們公認(rèn)的，參與葉片衰老調(diào)控的激素主要有促進(jìn)衰老的乙烯、水楊酸、茉莉酸、脫落酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯等，以及抑制衰老的細(xì)胞分裂素。

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