【摘要】：隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展,純系以其基因組簡單便于分析而備受關(guān)注。柑橘作為世界上最重要的水果之一,雖然已獲得部分純系材料,但群體較小且涉及的遺傳背景較為相似,因此,擴大柑橘純系群體的工作任重道遠。柑橘廣泛存在的珠心胚現(xiàn)象,以及童期長、基因組高度雜合等特點,使其無法通過傳統(tǒng)的自交獲得純系�；ㄋ幣囵B(yǎng)是創(chuàng)制柑橘純系群體的首選技術(shù)。游離小孢子培養(yǎng)為直觀地呈現(xiàn)胚離體再生過程提供可能,同時有效減輕后續(xù)篩選鑒定的工作量,該項技術(shù)已被應用于多個物種。本實驗通過花藥培養(yǎng)擴大柑橘純系群體,并嘗試柑橘游離小孢子培養(yǎng);同時,對前人創(chuàng)制的純系材料進行細胞學鑒定。主要結(jié)果如下:1.對柑橘9個品種進行花藥培養(yǎng),共再生85個胚狀體,其中枳32個,墨西哥萊檬24個,早花檸檬23個,早金甜橙3個,暗柳橙、露德紅夏橙、紅暗柳橙各1個。其中46個胚狀體生芽,部分離體嫁接于枳砧,隨后移栽至溫室,其它仍處于繼代過程中。選取部分胚狀體提取DNA,通過SSR分子標記鑒定再生胚狀體的基因型,表明枳、紅暗柳橙、早金甜橙均為雜合體;萊檬及墨西哥萊檬均為純合體,所有再生植株倍性均為二倍體�；ㄋ幣囵B(yǎng)過程中,比較花蕾大小、花期、低溫預處理時間對花藥培養(yǎng)再生率的影響,發(fā)現(xiàn)開花在12月的早花檸檬及1月的萊檬再生率明顯高于3月開花的枳,而4月開花的其它6個品種的再生率更低;低溫預處理7-8d,其再生率高于其它預處理。2.對10個柑橘品種進行游離小孢子培養(yǎng),參考前人的培養(yǎng)過程稍加改良,預處理液以0.4 mol/L甘露醇為基礎(chǔ)設(shè)置3種處理,培養(yǎng)基以MCM及BH_3為基礎(chǔ)進行多種改良,培養(yǎng)密度設(shè)置4個梯度。對比多種處理發(fā)現(xiàn),以含1%DMSO的0.4 mol/L甘露醇作為預處理液,小孢子細胞更傾向于形成類似胚狀體的致密細胞團,但其它處理對小孢子細胞的再生幾乎沒有影響。該實驗中獲得的致密細胞團沒有繼續(xù)發(fā)育。3.對早金甜橙7個純系愈傷組織進行染色體制片,獲得部分較清晰的染色體圖像,發(fā)現(xiàn)雙單倍體愈傷較單倍體愈傷更易發(fā)生染色體加倍,這些不同純系的染色體圖像可以用于后續(xù)的純系細胞學研究。
【圖文】：

取大小不同的花蕾剝?nèi)』ㄋ庍M行簡單壓片觀察,用 1 %醋酸洋紅或 DAPI時期的確定及花粉活力的鑒定(圖 1)。通過觀察細胞核的位置，，將大部分單核靠邊期的花蕾大小作為重點采樣對象。采集到的花蕾進行預處理，即理 3-8 d。預處理后的花蕾用游標卡尺進行大小分級，然后分別進行表面消毒，消照王淑明博士畢業(yè)論文，具體如下：1. 10% HCl 浸泡 30 s，倒出 HCl 液體；2. 50%次氯酸鈉（有效氯大于 5%）浸泡 10 min，期間不斷輕輕搖晃并用烤不被液體浸沒的部位；3.加入無菌水清洗 3-5 次，每次浸泡 3-5 min，每次更換液體均需更換無。

將上述剝得的花藥置于三種不同的預處理液（圖2a），分別為 0.4 mol/L 甘露醇（記作 control，參照 Chiancone et al 2015a）、0.4 mol/L甘露醇加入 1%二甲亞砜（記作 1% DMSO，參照 Echavarri et al 2015）、0.4 mol/L 甘露醇代替 MT 液體培養(yǎng)基中的蔗糖（記作 0.4M+MT，參照 Echavarri et al 2015）中，搖床 50 r/min 黑暗處理 7 d，溫度條件為 28 ℃。圖 2 游離小孢子培養(yǎng)過程a．含 1% DMSO 的甘露醇處理 7d 的高班柚花藥 b．游離小孢子培養(yǎng)過程中的致密顆粒 c．培養(yǎng)初始狀態(tài)的小孢子細胞 d．培養(yǎng)過程中的細胞團 a-b 標尺為 1 cm c-d 標尺為 40 μm.Fig 2 Isolated microspore culture processa. ‘ Kaopan’ pummelo’s anther treated with Mannitol containing 1%DMSO for 7 days b. dense granule of isolatedmicrospore culture process c. microspore at culture initial stage d. cell mass of culture process a-b: bar= 1cm c-d:bar=40μm.7 d 黑暗處理后導出小孢子，方法參照 Chiancone 等（2015a）的報道稍作修改
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S666

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 解凱東;王曉培;王惠芹;梁武軍;謝宗周;郭大勇;伊華林;鄧秀新;Grosser Jude W.;郭文武;;以柑橘多胚性二倍體母本倍性雜交培育三倍體[J];園藝學報;2014年04期

2 韓毅科,杜勝利,王鳴,張桂華;黃瓜染色體加倍研究[J];天津農(nóng)業(yè)科學;2002年02期

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 王淑明;柑橘純合種質(zhì)創(chuàng)制及早金甜橙DH系代謝與轉(zhuǎn)錄組分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

2 蘭紅;甜橙細胞遺傳學圖譜構(gòu)建和脆性位點分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前3條

1 李恩惠;短童期資源山金柑與早實枳、早花檸檬體細胞雜交及再生植株的分子鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 王蓉;柑橘體細胞雜種核仁共顯性機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

3 張亞莎;柑橘體細胞融合創(chuàng)制三倍體無核新種質(zhì)及融合再生植株的遺傳鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

本文編號：2694302