【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源非編碼RNA,可以從轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因的表達(dá),在植物的多種生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。miR396作為植物中保守的一類miRNA,對(duì)于植物花器官發(fā)育、作物籽粒大小、作物產(chǎn)量等生理過(guò)程具有重要作用,然而miR396對(duì)于果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)、產(chǎn)量等重要性狀的作用還未被研究。本研究以番茄品種Micro-Tom為材料,對(duì)番茄中的miR396及其靶基因進(jìn)行了鑒定及表達(dá)模式分析,并分別對(duì)利用短串聯(lián)目標(biāo)模擬(Short Tandem Target Mimic,STTM)方法抑制miR396功能的STTM396轉(zhuǎn)基因番茄和超表達(dá)不同miR396靶基因的轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行了研究,揭示了 miR396及其不同靶基因在番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用,主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)番茄中的miR396及其靶基因進(jìn)行了鑒定和表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)miR396靶基因在幼果時(shí)期表達(dá)量高于綠熟時(shí)期果實(shí),為研究miR396對(duì)于番茄果實(shí)的影響打下了基礎(chǔ)。番茄中的miR396包括miR396a和miR396b,表達(dá)分析顯示miR396a在番茄各組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于miR396b。番茄中miR396的靶基因主要是生長(zhǎng)調(diào)控因子(Growth Regulating Factors,GRFs),番茄中共有13個(gè)GRFs,其中8個(gè)GRFs是miR396的靶基因,此外胞嘧啶DNA甲基化酶DRM5(Solyc02g062740)和MAD 家族的 MADS 基因(Solyc01g066730)也是 miR396的靶基因,表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)miR396的這10個(gè)靶基因在番茄幼果中的表達(dá)量顯著高于綠熟時(shí)期果實(shí)。(2)miR396功能抑制的STTM396轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)及萼片顯著變大,表明miR396對(duì)于番茄果實(shí)及萼片的大小具有重要的調(diào)控作用。miR396功能抑制的STTM396轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)重量、長(zhǎng)度、寬度、高度、心室數(shù)、表皮細(xì)胞面積、果皮厚度和萼片大小、萼片細(xì)胞面積及細(xì)胞數(shù)目都顯著增加。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示STTM396番茄果實(shí)及萼片中的miR396a和miR396b都顯著下調(diào),miR396的10個(gè)靶基因大部分上調(diào),尤其是GRF1、GRF2、GRF3及GRF4及GRF5。(3)STTM396轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),miR396靶基因中的5個(gè)GRFs可能對(duì)番茄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用,并且發(fā)現(xiàn)miR396影響細(xì)胞壁和植物激素相關(guān)基因的表達(dá)。miR396靶基因中的GRF1、GRF2、GRF3、GRF4及GRF5在STTM396番茄果實(shí)中表達(dá)值升高最明顯,而miR396其他5個(gè)靶基因及果實(shí)大小和形狀相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)的表達(dá)基本沒(méi)變化或表達(dá)值很低。差異表達(dá)基因主要富集到細(xì)胞壁相關(guān)條目,尤其是果膠裂解酶和果膠酯酶基因明顯下調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)STTM396番茄果實(shí)的硬度、原果膠含量和總果膠含量顯著增加,此外植物激素乙烯、生長(zhǎng)素和赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著變化。(4)超表達(dá)不同miR396靶基因GRFs后,發(fā)現(xiàn)miR396通過(guò)調(diào)控不同靶基因GRFs影響果實(shí)重量、心室數(shù)、光澤度、果皮厚度、萼片長(zhǎng)度和寬度。利用橋接PCR技術(shù),將5個(gè)GRFs分別同義突變成抗miR396剪切的rGRFs。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),獲得了 5種分別超表達(dá)rGRFs的rGRFs-OE轉(zhuǎn)基因番茄,表型分析發(fā)現(xiàn)rGRF1-OE的番茄果實(shí)性狀基本不變;rGRF2-OE的番茄果實(shí)光澤度變暗,果實(shí)重量減輕;rGRF3-OE的番茄果實(shí)光澤度變暗,重量基本不變;rGRF4-OE通過(guò)顯著增加果皮厚度使果實(shí)重量明顯增加;rGRF5-OE通過(guò)顯著增加果實(shí)心室數(shù)使番茄果實(shí)重量明顯增加;rGRF1-OE的番茄萼片大小基本不變,其余4種rGRFs-OE的萼片寬度都增加,但rGRF2-OE和rGRF4-OE的萼片長(zhǎng)度基本不變,rGRF3-OE萼片長(zhǎng)度變大,而rGRF5-OE萼片長(zhǎng)度顯著變小。綜上,miR396通過(guò)調(diào)控其靶基因GRF2、GRF3、GRF4和GRF5影響了番茄果實(shí)及萼片的生長(zhǎng)發(fā)育,本研究為miR396參與調(diào)控果實(shí)及萼片的生長(zhǎng)發(fā)育提供了依據(jù)。
【圖文】：

邐ＭＩＴＥ逡逑ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ邋ｅｌｅｍｅｎｔ逡逑圖１－２植物ｍｉＲＮＡｓ的合成及ｍｉＲＮＡ基因的起源（Ｖｏｉｎｎｅｔ，２００９）逡逑（Ａ）植物ｍｉＲＮＡｓ的合成。（Ｂ）植物ｍｉＲＮＡ基因起源于反向基因重復(fù)事件。（Ｃ）植物逡逑ｍｉＲＮＡ基因起源于自然進(jìn)化。（Ｄ）植物ｍｉＲＮＡ基因起源于轉(zhuǎn)座元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡｓ邋ａｎｄ邋ｏｒｉｇｉｎｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋（Ｖｏｉｎｎｅｔ，邋２００９）逡逑（Ａ）邋Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡｓ．邋（Ｂ）邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ａｎ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑ｅｖｅｎｔ．邋（Ｃ）邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．邋（Ｄ）邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ逡逑ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ邋ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑（二）植物中ｍｉＲＮＡ的作用機(jī)制逡逑研究表明，ｍｉＲＮＡ可以通過(guò)剪切、翻譯抑制或ＤＮＡ甲基化三種方式對(duì)其靶基因逡逑進(jìn)行調(diào)控，即２１邋ｎｔ的ｍｉＲＮＡ主要與ＡＧ０１結(jié)合導(dǎo)致靶基因的剪切或翻譯抑制，在逡逑轉(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因，而２４邋ｎｔ的ｍｉＲＮＡ主要與ＡＧ０４結(jié)合在細(xì)胞核內(nèi)引起靶基逡逑因ＤＮＡ甲基化

邐ＡＧＯ邋Ｔｕｒｎｏｖｅｒ邐Ｖａｃｕｏｌｅ逡逑圖１－３植物中ｍｉＲＮＡ介導(dǎo)的基因沉默示意圖（Ｒｏｇｅｒｓ邋ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ，邋２０１３）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｇｅｎｅ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋（Ｒｏｇｅｒｓ邋ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ，邋２０１３）逡逑ｍｉＲＮＡ的作用機(jī)制中，ＡＧＯ蛋白發(fā)揮著重要功能。在不同的植物物種中，ＡＧＯｓ逡逑家族的成員數(shù)量也有很大差異，如在擬南芥中存在１０個(gè)ＡＧＯｓ蛋白，在水稻中含有逡逑１９個(gè)ＡＧＯｓ蛋白，而在綠藻ＣＷｏｍ少ｃ／ｏｍｏｗｏｓ邋ｒｅ／ｗ／ｗｒａＷ中只含有３個(gè)ＡＧＯｓ蛋白逡逑（Ｒｏｇｅｒｓ邋ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ，邋２０１３；邋Ｆａｎｇ邋ａｎｄ邋Ｑｉ，，２０１６）。所有真核生物的邋ＡＧＯｓ邋蛋白都存在邋ＰＡＺ逡逑結(jié)構(gòu)域和ＰＩＷＩ結(jié)構(gòu)域，ＰＡＺ結(jié)構(gòu)域含有寡核苷酸／寡核苷酸結(jié)合域，能夠結(jié)合ｍｉＲＮＡｓ，逡逑而ＰＩＷＩ結(jié)構(gòu)域含有ＲＮａｓｅＨ－ｌｉｋｅ功能，能夠剪切與ｍｉＲＮＡ互補(bǔ)的靶基因（Ｒｏｇｅｒｓ逡逑ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S641.2


本文編號(hào)：2693971