【摘要】：藍(lán)莓(Vaccinium spp.),在其它植物能夠正常生長的條件下仍易出現(xiàn)缺Fe性失綠,即其Fe營養(yǎng)代謝具有明顯的低效性,但相關(guān)機(jī)理仍不明確。目前,對藍(lán)莓Fe營養(yǎng)生理的有限報(bào)道表明,藍(lán)莓根系對Fe的吸收與擬南芥一樣,包括Fe的活化、還原及吸收等環(huán)節(jié),但不明確上述Fe吸收過程中的限速環(huán)節(jié);另外,調(diào)控藍(lán)莓缺Fe性響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子、以及轉(zhuǎn)錄因子作用的關(guān)鍵靶基因亦尚未明確。本研究擬通過水培方法進(jìn)行缺鐵與非酸性條件試驗(yàn),再通過多項(xiàng)生理指標(biāo)測定,并結(jié)合鐵代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量的變化分析,來探討缺鐵與非酸性條件對藍(lán)莓鐵營養(yǎng)代謝的影響。并在分離藍(lán)莓Fe代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因FER(Iron deficiency-induced transcription factor,FER)、FRO2(Ferric reduction oxidase 2,FRO2)以及IRT1(Iron-regulated transporter 1,IRT1)的 cDNA 全長的基礎(chǔ)上,構(gòu)建表達(dá)載體,再將其遺傳轉(zhuǎn)化至擬南芥同源基因突變體中,用于分析轉(zhuǎn)基因株系的Fe營養(yǎng)生理及缺Fe響應(yīng)機(jī)理,來探討藍(lán)莓Fe低效營養(yǎng)的內(nèi)在機(jī)理。這將對解決生產(chǎn)中藍(lán)莓缺Fe的問題、栽培管理及生物技術(shù)育種發(fā)揮積極的推動作用。具體研究結(jié)果如下:缺Fe條件下,首先影響到藍(lán)莓新生葉片F(xiàn)e營養(yǎng)供應(yīng),導(dǎo)致藍(lán)莓葉綠素合成受阻,葉片呈現(xiàn)黃化現(xiàn)象,葉綠素含量降至對照組的55%左右。當(dāng)根系缺Fe時(shí),藍(lán)莓根系活力減弱至對照組的66.7%,根系Fe含量僅為正常供Fe組的33.95%。藍(lán)莓葉和根部FRO活性分別為對照組的1.26、1.38倍,說明藍(lán)莓仍能應(yīng)激性地提高VcFRO2基因表達(dá)量及蛋白活性。非酸性條件處理下,藍(lán)莓根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,且根系活力極顯著下降至對照組的1/3,而新長嫩葉出現(xiàn)除葉脈外的黃化現(xiàn)象。qRT-PCR結(jié)果表明,缺鐵情況下VcFER在3個時(shí)期均出現(xiàn)顯著性上調(diào)的現(xiàn)象,但缺Fe處理10 d時(shí),VcFRO2及VcIRT1表達(dá)量均未顯著提高,表明下游基因 VcFRO2、VcIRT1 相對表達(dá)量變化滯后于VcFER 而fer2(Ferritin2,Fer2)均出現(xiàn)顯著性下調(diào),以此降低體內(nèi)儲藏鐵含量;同時(shí),缺Fe處理20 d后,與胞內(nèi)Fe 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Nramp(Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 3,Nramp3)的相對表達(dá)量顯著上調(diào)至4倍以上,該基因上調(diào)將有利于液泡中的鐵往細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)輸。而VcHA(H+-ATPase,HA)表達(dá)無差異,表明缺鐵并不導(dǎo)致藍(lán)莓分泌過多的H+到土壤中。從藍(lán)莓中分離擴(kuò)增到939 bp VcFER、1071 bp VcIRT1、2106bp VcFRO2的cDNA全長序列,并構(gòu)建了三個基因的超表達(dá)載體,用于遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥同源突變體。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),VcFER是屬于HLH超家族的轉(zhuǎn)錄因子,VcFRO2屬于鐵氧環(huán)蛋白還原酶超家族,IRT1是屬于Zip超家族的金屬蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析三個基因與大多數(shù)物種的親緣關(guān)系不高。分析表明,藍(lán)莓的VcFER、VcIRT1蛋白序列與其它物種存在較大差異性,親緣性不高,有可能是導(dǎo)致其Fe低效營養(yǎng)的重要原因。轉(zhuǎn)基因研究表明,Atfit/VcFER陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株較Atft突變體植株黃化性狀有較顯著改善,但未完全回復(fù)突變。Atirt/VcIRT1轉(zhuǎn)基因植株顯著改善了突變體的黃化癥狀,主要表現(xiàn)為植株相對健壯,但到花期其葉片與WT相比仍有出現(xiàn)輕微黃化現(xiàn)象。Atfro/VcFRO2抗性植株出現(xiàn)嚴(yán)重黃化,最終葉片泛白死亡,無法正常長大,由此可見,VcFRO2對三價(jià)鐵離子的還原力偏低。綜上可見,藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄因子VcFER的低效性,缺乏對根際酸化機(jī)制,以及VcFRO2活性偏低,這可能是藍(lán)莓Fe營養(yǎng)低效的關(guān)鍵原因。
【圖文】：

提高轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平增加根部細(xì)胞質(zhì)膜上高鐵還原酶（Ｆｅｒｒｉｃ邋ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ逡逑ｏｘｉｄａｓｅ，邐表達(dá)量，以增強(qiáng)Ｆｅ３＋還原成Ｆｅ２＋的能力；（３）提尚根對Ｆｅ吸收逡逑過程中以ＩＲＴ１為主的轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)量（見圖１．１）。逡逑Ｐｈｅｎｏｈｃｓ邐ｃｈｅｌａｔｅ＾＃蓿蓿澹]3?Ｉ邐—■？？？？邐—．———＂…ｉ逡逑＿邐Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋Ｉ逡逑Ｉ邋ｍ邋Ａ邋Ａ邋Ｉ逡逑ｍｍｍｍ邋Ｐ￡Ｚ？邋Ｍ邋ＨＡ邐，：匕＇＇＾＾２／，邐邐邐逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑Ｐｈｅ＾５邋＿邋Ｈ＊邐邐邋Ｆｅ＞邐ｃｙｔｏｓｏｌ邋｜逡逑圖１．１機(jī)理Ｉ植物根系吸收Ｆｅ過程逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｉｒｏｎ邋ｕｐｔａｋｅ邋ｉｎ邋Ｓｔｒａｔｅｇｙ邋Ｉ邋ｐｌａｎｔ逡逑注：橢圓代表機(jī)理ｉ中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)子或酶，它們均會受到缺鐵誘導(dǎo)引起相應(yīng)的表達(dá)變化。逡逑ＰＥＺ是酚類物質(zhì)輸出轉(zhuǎn)運(yùn)子；ＨＡ是Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ；邋ＦＲＯ為高鐵還原酶氧化酶；ＩＲＴ為鐵調(diào)控逡逑的轉(zhuǎn)運(yùn)子，本圖引用于Ｋｏｂａｙａｓｈｉ和Ｎｉｓｈｉｚａｗａ邋（２０１２）［２９］。逡逑通過番茄和擬南芥的研究表明，信號分子也可影響植物缺鐵反應(yīng)，植物缺鐵逡逑會導(dǎo)致根部ＮＯ積累，當(dāng)清除植物根部ＮＯ則不能誘導(dǎo)尸現(xiàn)／Ｆ／ｒ及其下游漢７７ＦＪ？０逡逑基因的表達(dá)［３Ｑ］。其中生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素和茉莉酮酸酯也可能參與植物根逡逑部Ｆｅ吸收機(jī)制的調(diào)控（見圖１．２）。逡逑Ｆｅ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ逡逑Ｉ逡逑Ｐｈｌｏｅｍ邋Ｆｅ逡逑Ａｕｘｉｎ逡逑Ｅｔｈｙｌｅｎｅ邋ＮＯ邐—＊—逡逑＼Ｆｅ邋ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ邋ｇｅｎｅｓ逡逑「逡逑ＦＩＴ邋｜邐

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【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S663.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2671713