【摘要】：‘富士’是我國蘋果的主要栽培品種,但其存在花芽難形成且質(zhì)量差等現(xiàn)實生產(chǎn)難題,嚴重限制了我國蘋果的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)。研究表明,DNA甲基化在植物成花調(diào)控、生長發(fā)育及逆境脅迫等多種生物學過程具有重要作用。但對于木本果樹蘋果,其全基因組DNA甲基化水平、及其調(diào)控的關(guān)鍵核心基因共同介導的成花調(diào)控機制尚不清楚。因此探究蘋果不同開花能力類型芽基因表達模式和其甲基化水平,挖掘在不同開花能力類型芽中基因甲基化狀態(tài)與表達水平間的關(guān)系,對于解釋DNA甲基化在蘋果成花調(diào)控中的作用、豐富蘋果成花誘導調(diào)控基礎(chǔ)理論,具有重要的理論與現(xiàn)實意義。本研究以蘋果‘長富2號’品種易成花的短枝頂芽、難成花的長枝頂芽以及基本不成花的腋芽為材料,對比3種不同成花能力類型芽形態(tài)生理特性差異,利用RNA-seq和WGBS技術(shù),鑒定比較分析三者全基因組DNA甲基化水平,及其與相關(guān)基因之間的調(diào)控關(guān)系。篩選差異DNA和基因表達水平的候選關(guān)鍵基因MdCDF2,并解析其涉及的DNA甲基化過程參與蘋果成花的調(diào)控機制。獲得主要研究結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)錄組比較分析。構(gòu)建了蘋果‘長富2號’3種不同開花能力類型芽RNA-seq文庫,分析比較不同芽之間形態(tài)生理特征,發(fā)現(xiàn)較之另外2種類型芽,短枝頂芽中IAA、BR、GA和CTK含量較低,但ABA和碳水化合物含量較高。發(fā)現(xiàn)Sb vs Lb、Sb vs Ab、Lb vs Ab鑒定出來的差異表達基因的數(shù)量分別為674、750和524個。這些差異基因主要涉及糖代謝,如蔗糖合成基因(SUS5和SUS6),脂質(zhì)轉(zhuǎn)運基因(VAS),碳水化合物代謝基因(TPP1和TPR1等),在短枝頂芽中,這些基因的相對表達量顯著高于長枝頂芽和腋芽;激素合成與代謝,如脫落酸合成相關(guān)基因(NCED1和CCD4),信號響應(yīng)相關(guān)基因(PYL4)等在短枝頂芽中均顯著上調(diào)表達;及成花基因,如其中包括花發(fā)育相關(guān)基因SPL13,SOC1和AP1等顯著差異表達。另外,一些核心轉(zhuǎn)錄因子,如WOX1,WRKY13和HSP70在短枝頂芽中均上調(diào)表達。2.DNA甲基化比較分析。構(gòu)建了蘋果‘長富2號’3種不同開花能力類型芽全基因組BS-seq文庫,鑒定了全基因組DNA甲基化圖譜。檢測了這3種類型芽的全基因組甲基化模式,發(fā)現(xiàn)CHH模式的甲基化水平在腋芽中最高,約占69.16%,而CG和CHG模式的甲基化水平在長枝頂芽中最高,分別為16.71%和15.42%。通過對3種芽不同基因區(qū)域DNA甲基化水平比較分析,發(fā)現(xiàn)不同開花能力類型芽的不同基因區(qū)域甲基化水平存在明顯差異。在3種甲基化模式下,長枝頂芽基因啟動子、5′UTR、外顯子、內(nèi)含子和3′UTR的DNA甲基化水平相對高于短枝頂芽,而且基本不成花的腋芽基因DNA甲基化水平也明顯高于易成花的短枝頂芽,這可能是其成花難的原因之一。另外,鑒定了3個比較組中差異甲基化區(qū)域,將蘋果不同開花能力類型芽高甲基化和低甲基化的差異甲基化區(qū)域進行可視化,與長枝頂芽和腋芽相比,CDF2基因在短枝頂芽中出現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象。3.DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄豐度相關(guān)性分析。根據(jù)基因FPKM值,分為4組:不表達(none:FPKM0.1),低表達(1st:0.1FPKM10),中度表達(2nd:10FPKM100),高表達(3rd:FPKM100);根據(jù)DNA甲基化水平,分為5組:甲基化水平20%;20%甲基化水平40%;40%甲基化水平60%;60%甲基化水平80%;甲基化水平80%。發(fā)現(xiàn),在蘋果不同開花能力類型芽中g(shù)ene-body區(qū)域甲基化水平最高(第5組)的基因其表達水平最低,表明gene-body區(qū)域甲基化和基因表達呈負相關(guān)。與之相反,啟動子區(qū)域甲基化水平最低的基因(第1組)在芽中的表達水平也最低,說明在啟動子區(qū)域基因甲基化與其表達呈現(xiàn)正相關(guān)。4.候選基因家族MdCDFs鑒定、表達分析及MdCDF2功能研究。發(fā)現(xiàn)在蘋果基因組中共有該家族成員11個,對其進行了理化特性、進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)等分析。通過RT-qPCR檢測了所有MdCDF基因成花誘導階段,在‘長富2號’及蔗糖處理后的表達模式,MdCDF2和MdCDF6響應(yīng)蔗糖處理顯著下調(diào)表達;亞細胞定位表明2個基因均定位于細胞核,且OE-MdCDF2過表達擬南芥出現(xiàn)明顯的晚花表型。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S661.1

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