【摘要】：珍珠黃楊樹姿蒼勁,株型矮小,具有極高的觀賞價值,對于珍珠黃楊矮化機制方面的研究卻很少報道,GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或生物合成受阻是植物矮化的一個重要因素,DELLA蛋白是GA信號傳導(dǎo)途徑中重要的負(fù)調(diào)控因子,本論文研究了珍珠黃楊矮化有關(guān)的DELLA蛋白家族BsGAI1、BsGAI2基因,結(jié)果如下:(1)利用同源克隆技術(shù)和末端快速擴增技術(shù)(RACE)獲得珍珠黃楊矮化的DELLA蛋白家族的BsGAI1、BsGAI2基因,獲得完整的cDNA序列,長度分別為:2576bp、2305bp;編碼區(qū)長度分別為1884bp、1836bp,分別編碼627aa、612aa個氨基酸序列。對BsGAI1、BsGAI2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析:BsGAI1分子式為C2951H4637N821O928S29,分子量為67.39kD;BsGAI2蛋白的分子式為:C2891H4541N811O908S30,分子量為66.15kD;且兩個蛋白均為不穩(wěn)定的親水性蛋白。對BsGAI1、BsGAI2基因編碼蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析:BsGAI1、BsGAI2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和隨機卷曲為主。在BsGAI1、BsGAI2基因編碼的氨基酸序列中具有DELLA蛋白家族所具有的功能活性位點和特征保守單元,N端存在非常保守的DELLA和TVHYNP結(jié)構(gòu)域,C端結(jié)構(gòu)高度保守,存在VHIID、RVER和SAW結(jié)構(gòu)域。(2)對珍珠黃楊BsGAI1、BsGAI2基因在不同組織進(jìn)行實時熒光定量表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)珍珠黃楊BsGAI1基因在莖中表達(dá)量最高,在根中表達(dá)量最低;BsGAI2基因在莖中表達(dá)量最高,在花中表達(dá)量最低。對BsGAI1、BsGAI2基因在珍珠黃楊不同時期的表達(dá)差異進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)BsGAI1在2016年7月份的葉、莖、根中的表達(dá)量比1月、9月相同組織的表達(dá)量都高,說明珍珠黃楊在夏季生長旺盛時候,BsGAI1的表達(dá)量也會有所增加,而在9月份中,BsGAI1在莖中的表達(dá)量比葉和根中有顯著的提高,隨著時間的推移,BsGAI1在莖中的表達(dá)量不斷積累而有所增加,表明珍珠黃楊BsGAI1基因在莖節(jié)間縮短以致植株矮化起著重要的調(diào)節(jié)作用。與BsGAI1的表達(dá)量相比,BsGAI2在1月、7月、9月的表達(dá)量有所差異,BsGAI2在三個月份中的表達(dá)量并不是在莖中最高,說明不同基因在不同生長時期植物組織中存在差異表達(dá)。(3)利用雙酶切法構(gòu)建BsGAI2的GFP融合表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到模式植物煙草中,并通過基因組PCR檢測、表型分析、GFP熒光檢測、IAA和GA3內(nèi)源激素測定以及噴施外源GA3等方法鑒定轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的差異。與野生型煙草相比,BsGAI2轉(zhuǎn)基因煙草呈生長減緩,出現(xiàn)矮化的趨勢,節(jié)間較短、粗壯,長勢較慢,根系生長慢,須根較少。利用熒光顯微鏡的GFP熒光蛋白的信號采集觀察轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草各個組織。發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草嫩莖的木質(zhì)部有明亮的熒光信號,節(jié)間聚焦位置的細(xì)胞中能見到明顯的熒光聚集的信號,頂芽、葉、根中也有明亮的熒光信號,在野生型煙草未見到有熒光聚集的信號。進(jìn)行IAA、GA3內(nèi)源激素測定,發(fā)現(xiàn)BsGAI2轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的IAA內(nèi)源激素含量總體上差異不大,而轉(zhuǎn)基因煙草GA3含量比野生型要高些,GA3含量的增加并沒有改變植株矮化的狀態(tài),說明BsGAI2基因?qū)τ谥参锇鹬匾恼{(diào)節(jié)作用。噴施外源GA3后,轉(zhuǎn)基因植株和野生型煙草的節(jié)間伸長和莖段生長速度加快,說明BsGAI2基因轉(zhuǎn)入野生型煙草中,植株中正常基因的表達(dá)水平受到了抑制,造成植株矮化。隨著外源GA3的噴施,使得植株體內(nèi)的GA表達(dá)恢復(fù)常態(tài),植株的生長狀況逐漸恢復(fù)到正常水平。
【圖文】：

成了復(fù)合體 GA/GID1/DELLA 結(jié)構(gòu)，受體 GID1 口袋覆蓋著 GA，DELLA 蛋白與的“蓋子”相互連接，下游的 F-box 蛋白與復(fù)合體 GA/GID1/DELLA 結(jié)合在一起 DELLA 的降解，DELLA 蛋白抑制作用被解除，植物可以繼續(xù)生長，GA 對植物導(dǎo)和其他的 GA 反應(yīng)也得以繼續(xù)，，這就是 GA 與其受體 GID1 對 DELLA 蛋白的“（de-repress）模式（圖 1.1）[57-59]。

DELLA蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S687

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2644519