【摘要】：柑橘屬于非躍變型果實,其成熟衰老機(jī)制及采后生物學(xué)特性有別于擬南芥等模式植物及水稻等大田作物,也不同于番茄和蘋果等呼吸躍變型果實。目前對于柑橘果實成熟衰老的研究主要集中在對表型性狀(果皮色澤、果肉糖酸及采后抗性能力等)的描述方面,對調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識還十分有限。本課題組前期已構(gòu)建了柑橘果實采后衰老的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子和激素子網(wǎng)絡(luò)可能在柑橘果實成熟衰老中行使著重要功能,但還缺乏具體的實驗數(shù)據(jù)支撐。因此,本研究依托普通甌柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)、其成熟衰老延緩?fù)蛔凅w青甌柑及青甌柑回復(fù)突變?yōu)槠胀óT柑果實為材料,系統(tǒng)地研究了果實成熟衰老過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。此外本實驗室前期研究表明水楊酸(Salicylic acid,SA)和油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因在青甌柑和普通甌柑果實貯藏期及不同柑橘種類貯藏期差異表達(dá)基因中呈現(xiàn)明顯的富集趨勢。為了探究這兩種激素對柑橘采后衰老的影響,本研究以成熟的溫州蜜柑(Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)果實為材料,通過外源SA及油菜素內(nèi)酯類似物24-表油菜素內(nèi)酯(24-epibrassinolide,EBR)處理,深入解析了它們對柑橘采后衰老的影響。主要研究結(jié)果如下:1.證明了青甌柑是果實成熟衰老延緩?fù)蛔凅w。對普通甌柑、青甌柑及回復(fù)突變材料果實成熟衰老相關(guān)表型分析發(fā)現(xiàn),青甌柑果實成熟衰老明顯延緩,其有色層色澤轉(zhuǎn)變、果肉含酸量下降等表型較普通甌柑果實均顯著延緩。對有色層葉綠素及類胡蘿卜素定量后發(fā)現(xiàn),青甌柑中葉綠素及在葉綠體中積累的α、β-胡蘿卜素及葉黃素下降速率顯著減緩。作為有色層中β-胡蘿卜素下游產(chǎn)物及成熟柑橘果實主要呈色色素,青甌柑中β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)及9-順式紫黃質(zhì)等色素含量顯著低于普通甌柑。普通甌柑有色層中ABA含量隨著果實成熟進(jìn)程的推進(jìn)而逐漸升高;青甌柑有色層ABA含量并未伴隨著成熟推進(jìn)而升高,并且其濃度顯著低于普通甌柑有色層ABA濃度。青甌柑與回復(fù)突變材料相關(guān)表型差異與青甌柑和普通甌柑果實類似。以上結(jié)果表明青甌柑果實呈現(xiàn)出明顯的成熟衰老延緩表型,并且其表型是由于α、β-胡蘿卜素向下游轉(zhuǎn)化延緩導(dǎo)致葉綠體轉(zhuǎn)化及有色層呈色色素合成受阻,以及ABA合成延緩導(dǎo)致果實成熟衰老進(jìn)程無法正常起始所致。2.轉(zhuǎn)錄因子CrMYB68和CrNAC036通過調(diào)控類胡蘿卜素代謝及ABA合成,延緩了青甌柑果實的成熟衰老。對青甌柑和普通甌柑果實發(fā)育期多個時間點類胡蘿卜素及ABA代謝通路相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)兩者之間α、β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化及ABA合成延緩的差異是由于CrBCH2和CrNCED5在青甌柑中持續(xù)下調(diào)表達(dá)所致。對前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)深入分析發(fā)現(xiàn)CrMYB68和CrNAC036兩個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與CrBCH2和CrNCED5的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。這四個基因的表達(dá)差異在青甌柑及其回復(fù)突變材料中得到進(jìn)一步證實。通過選擇性擴(kuò)增結(jié)合位點分析(Selected amplification and binding,SAAB)實驗證實CrMYB68蛋白能特異地結(jié)合到ACCTAC、ACCAAC和AACAAC序列上,而在CrBCH2和CrNCED5啟動子中包含CrMYB68的潛在結(jié)合位點。本研究通過凝膠遷移實驗(EMSA)證實CrMYB68能特異性結(jié)合到CrBCH2和CrNCED5啟動子上;雙熒光素酶實驗表明CrMYB68能顯著抑制CrBCH2和CrNCED5啟動子活性。通過瞬時超量轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana benthamiana)葉片及EMSA實驗進(jìn)一步證實CrMYB68同樣能特異性結(jié)合到NbBCH2和NbNCED5啟動子并抑制其基因的表達(dá)。對CrNAC036研究發(fā)現(xiàn)其能結(jié)合到CrNCED5啟動子上并抑制其基因表達(dá)。而ABA所誘導(dǎo)的成熟衰老相關(guān)基因如參與類胡蘿卜素合成的八氫番茄紅素合成酶基因(CrPSY)、參與細(xì)胞壁降解的果膠裂解酶基因(CrPectate Lyase)和細(xì)胞壁伸展蛋白A1和A8基因(CrExpansin A1,A8)在青甌柑中的表達(dá)量均低于普通甌柑。以上結(jié)果表明青甌柑果實成熟衰老延緩是由于CrMYB68及Cr NAC036在青甌柑中高表達(dá)所致:一方面高表達(dá)的CrMYB68通過抑制CrBCH2基因的表達(dá)而影響α、β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化從而影響有色層葉綠體轉(zhuǎn)化及有色層呈色色素合成;另一方面高表達(dá)的CrMYB68及CrNAC036通過抑制CrNCED5基因的表達(dá)而延緩ABA合成從而導(dǎo)致依賴ABA的果實成熟衰老進(jìn)程無法正常起始。以上結(jié)果表明ABA在正調(diào)控柑橘成熟衰老進(jìn)程中行使著重要功能,而綜合分析本課題前期預(yù)實驗、課題組前期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及前人研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)SA和油菜素內(nèi)酯可能在負(fù)調(diào)控柑橘成熟衰老調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。3.外源SA和EBR處理柑橘果實,可顯著改善其采后貯藏性能。為了驗證外源SA和EBR處理對柑橘采后性能的影響,本研究選擇了在我國栽培面積最大,成熟衰老快且不耐貯藏的溫州蜜柑果實為材料,進(jìn)行后續(xù)研究。選用2 mmol L~(-1)SA以及10μmol L~-11 EBR分別處理已達(dá)商業(yè)成熟度的國慶一號溫州蜜柑果實,并模擬生產(chǎn)進(jìn)行貯藏實驗和生理生化分析。結(jié)果表明:SA處理果實在貯藏50 d后腐爛率為對照果實的42.9%,并且顯著延緩了果實貯藏期間硬度的下降。而對抗病相關(guān)代謝物含量分析發(fā)現(xiàn),SA處理能顯著誘導(dǎo)H_2O_2和多甲氧基黃酮的積累從而增強(qiáng)果實抗病能力。外源EBR處理后,貯藏50 d時處理果實腐爛率僅為對照果實的21.4%,但EBR處理對果實內(nèi)在品質(zhì)并沒有顯著影響。我們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)EBR處理后,果實存在一個快速失水的過程,此表型與發(fā)汗處理類似。進(jìn)一步的實驗證明,EBR處理后果實中H_2O_2、絲氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸和脯氨酸等化合物的積累以及幾丁質(zhì)酶基因(chitinase)、苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanin ammonia lyase)的表達(dá)均被誘導(dǎo)。這些代謝物的積累及基因的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了果實的抗病能力。
【圖文】：

圖 1-1 柑橘果實發(fā)育期果面色澤變化 （Wang et al 2016a）。DPA：花后天數(shù)。Figure 1-2 The color transformation of citrus pericarp during the development stage (Wanget al 2016a). DPA: Days Post Anthesis.作為柑橘和芒果等果實的主要呈色色素，類胡蘿卜素是形成果實外觀品質(zhì)的重要組成部分。在果實成熟過程中，大量類胡蘿卜素以r{牛兒r{牛兒基焦磷酸（GGPP）為直接前體，合成直鏈態(tài)及環(huán)氧化胡蘿卜素。在直鏈態(tài)胡蘿卜素合成過程中由八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）將兩分子 GGPP 催化合成無色的八氫番茄紅素的步驟是關(guān)鍵的限速步驟（圖 1-2）（Lindgren et al2003,Cazzonelli and Pogson 2010）。隨后在八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）催化下，八氫番茄紅素發(fā)生脫氫反應(yīng)并在ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶（Z-ISO）和胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）作用下發(fā)生異構(gòu)化最終產(chǎn)生粉紅色的番茄紅素（Bartley et al 1991,Isaacson et al 2002,Breitenbach and Sandmann 2004,Li etal 2007）。此后番茄紅素在番茄紅素ε環(huán)化酶（LCYe）及番茄紅素β環(huán)化酶（LCYb）

類胡蘿卜素主要合成反應(yīng) （Cazzonelli and Pogson 2010）酸；HMBPP，4-羥基-2-甲基-2-己烯基 1 磷酸；IPP，異戊烯；GGPP，r{牛兒基r{牛兒基焦磷酸；DXS，1-脫氧-D-木酮-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶；HDS， 羥甲基丁烯基-4-磷酸-二磷酸還原酶；IPI，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶；GGPPS，PSY, 八氫番茄紅素合成酶；PDS，八氫番茄紅素脫氫酶TISO，胡蘿卜素異構(gòu)酶；β-LCY，番茄紅素β-環(huán)化酶；ε-Le，β-胡蘿卜素羥化酶；ε-OHase，，胡蘿卜素ε-羥化酶；VD黃質(zhì)環(huán)化酶；NXS，新黃質(zhì)合成酶；CCD，胡蘿卜素裂解雙蘿卜素雙加氧酶。carotenoid biosynthesis reaction in higher plants. (Cazz2-C-methyl-derythritol 4-phosphate; HMBPP, 4-hydr IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl ddiphosphate;DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate se 5-phosphate reductoisomerase; HDS,hydroxymethylbuthydroxymethylbutenyl 4-diphosphate reductase; IPI, isopPS, geranylgeranyl diphosphate synthase; PSY, phytoenase; ZDS, ζ-carotene desaturase; CRTISO, carotene isomeras
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S666

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2 陳世平;;福建·閩侯甌柑銷售形勢嚴(yán)峻[J];中國果業(yè)信息;2014年02期

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本文編號：2644535