【摘要】：本研究以原花青素含量較高的兔眼藍(lán)莓‘燦爛’(V.ashei‘Brightwell’)和原花青素含量較低的北高叢藍(lán)莓‘赫伯特’(V.corymbosum‘Herbert’)為實驗材料,克隆了其葉片中的原花青素合成酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)、花青素合成酶(Anthocyanin synthase,ANS)基因,分別命名為VaLAR1、VaLAR2、VaANS和VcLAR1、VcLAR2、VcANS。通過序列分析得知兩種材料相應(yīng)同源基因僅有少數(shù)幾個堿基位點的差異,相似性達(dá)99%;通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹得知上述基因與茶樹的遺傳距離最近。以來自‘赫伯特’的VcLAR1、VcLAR2、VcANS、VcANR(王麗金克隆)為目的基因,分別構(gòu)建了煙草脆裂病毒(TRV)載體,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化‘赫伯特’組培苗,對VIGS介導(dǎo)的‘赫伯特’組培苗基因沉默體系進(jìn)行初步探索。結(jié)果表明,VIGS介導(dǎo)‘赫伯特’組培苗沉默最佳體系為:農(nóng)桿菌菌液濃度OD_(600)值2.0,侵染時間為4 min,黑暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)移到光下,4周后采集樣品進(jìn)行檢測。本實驗成功沉默了‘赫伯特’組培苗VcLAR1基因,使其表達(dá)量下降,同時檢測到其葉片中原花青素含量下降。以來自‘燦爛’的VaLAR1、VaLAR2、VaANS、VaANR為目的基因,分別構(gòu)建植物雙元載體pCAMBIA 1302的重組質(zhì)粒,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化來自‘赫伯特’組培苗的外植體,探究了其遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過篩選,確定了‘赫伯特’外植體潮霉素(Hyg)抗性特點;通過正交實驗,確定了‘赫伯特’最佳農(nóng)桿菌侵染體系為:農(nóng)桿菌濃度的OD_(600)值為0.7、侵染時間為10 min、黑暗條件共培養(yǎng)6 d;目前獲得了轉(zhuǎn)VaLAR1、VaLAR2、VaANS、VaANR基因的‘赫伯特’抗性愈傷。
【圖文】：

不同的藍(lán)莓品種葉片中原花青素含量差異很大[33]。素研究進(jìn)展素（Proanthocyandins，，PA）是一類存在于植物體內(nèi)的多酚類單體聚合形成[34]。PA存在于所有的植物體內(nèi)，具有許多不同身而言可以防止食草動物的捕食和環(huán)境中病原體的攻擊，以37]。PA也廣泛存在于植物來源的食物中，特別是在水果、豆飲料中，如果汁、葡萄酒、蘋果酒、茶和可可。PA的味道是有影響[38-42]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)PA及其單體對人類健康具和抗癌活性，這些功能源于其具有較高的抗氧化和清除自由保護(hù)心臟、預(yù)防血栓形成、抵御紫外線等方面具有顯著效果[開發(fā)利用，主要應(yīng)用于保健品、食品和藥品等領(lǐng)域[46]。

LAR、ANS 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析從藍(lán)莓葉片中獲得的目的基因氨基酸序列與 NCBI 網(wǎng)站公布的其他植物基酸序列進(jìn)行序列比對和同源性分析，并根據(jù)比對結(jié)果，使用 MEGA6.0于氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，LAR、ANS 系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果分別為圖 2-4 2-4 為 LAR 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，從圖中可以看出，百脈根（Lotus cornicuGlycine max）、菜豆（Phaseolus coccineus）等幾種豆科植物的 LAR1 和序列聚為一支；而藍(lán)莓葉片中得到的 LAR 序列與其他木本植物的聚為一（Fagopyrum dibotrys）、可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifeMalus domestica）、西洋梨（Pyrus communis）、甜櫻桃（Prunus aviumragaria x ananassa）、玫瑰（Rosa rugosa）、啤酒花（Humulus lupulus）rella rubra）、提子（Vitis shuttleworthii）、金花茶（Camellia nitidissimaamellia sinensis）等，其中多數(shù)植物含有 LAR1 和 LAR2，少數(shù)植物只含藍(lán)莓葉片中得到的 LAR 與金茶花、茶樹的遺傳距離最近。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S663.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 蘇上;王麗金;王賀新;王亮生;;藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢[J];高科技與產(chǎn)業(yè)化;2014年04期

本文編號：2640869