【摘要】：紅苞鳳梨(Ananascomosusvar.bracteatus)作為重要的花葉觀賞植物,其嵌合形狀明顯,嵌合方式多樣,深入研究其葉色鑲嵌形成機(jī)理對提高嵌合性狀在繁育過程中的穩(wěn)定性和嵌合性狀的分子改良具有重要意義。本文以紅苞鳳梨金邊嵌合體經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的嵌合性狀分離的全綠、全白植株為典型材料,確定了紅苞鳳梨葉片白化細(xì)胞葉綠素合成受阻的關(guān)鍵步驟,篩選出葉片白化失綠突變的關(guān)鍵基因。并對AbhemC進(jìn)行了克隆、表達(dá)分析和功能驗(yàn)證,探討了其在紅苞鳳梨葉片白化中的作用,為進(jìn)一步分析紅苞鳳梨葉片白化的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。獲得的主要研究結(jié)果如下:1、紅苞鳳梨白化葉片葉綠素合成關(guān)鍵步驟的確定及白化關(guān)鍵基因的篩選。通過RNA-seq高通量測序,得到全綠、全白植株間差異表達(dá)的基因(DEG)共1431個(gè)。通過對DEGs進(jìn)行COG、GO和KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn),DEGs富集在葉綠素合成、葉綠體發(fā)育和光合作用等方面。通過KEGG功能注釋得到13個(gè)在葉綠素合成代謝過程中差異表達(dá)的基因。采用RT-qPCR對這13個(gè)DEGs在紅苞鳳梨組培全綠、全白植株中的表達(dá)模式分析表明,11個(gè)DEGs在全白植株中上調(diào)表達(dá),只有2個(gè)POR基因在全白植株中下調(diào)表達(dá)。RT-qPCR表達(dá)分析結(jié)果驗(yàn)證了表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)的可靠性。對紅苞鳳梨組培全綠、全白植株的葉綠素及葉綠素合成前體等相關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)白化葉片葉綠素生物合成受阻的限速步驟是PBG向UroⅢ的轉(zhuǎn)化。催化PBG轉(zhuǎn)化為UroⅢ的膽色素原脫氨酶(PBGD)和尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)的酶活性在全白葉中顯著降低。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異可以推測,hemC基因可能是關(guān)鍵基因,hemC基因編碼蛋白(PBGD)的功能受抑可能是白化細(xì)胞形成的關(guān)鍵因素。2、紅苞鳳梨AbhemwC基因的克隆及序列分析克隆得到2個(gè)AbhemC基因的cDNA序列,分別命名為AbhemC1和AbhemC2,兩個(gè)基因全長1135bp,ORF序列1116bp,編碼371個(gè)氨基酸,核酸序列比對有9個(gè)位點(diǎn)的堿基差異,氨基酸序列有2個(gè)位點(diǎn)的殘基差異。兩個(gè)基因都屬于hemC基因家族,具有hemC基因家族的特征保守域和保守氨基酸位點(diǎn):該基因編碼的蛋白與其他物種具有很高的保守性,相似性78%-82%,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行了分析。3、AbhemC基因在煙草中的功能鑒定選取AbhemC基因的保守序列,構(gòu)建干擾表達(dá)載體pFGC5941-AbhemC,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別將干擾表達(dá)載體pFGC5941-AbhemC和空表達(dá)載體pFGC5941轉(zhuǎn)入煙草中,經(jīng)PCR檢測得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)干擾載體的煙草(Ri)hemC基因表達(dá)量顯著低于陰性對照組(CK)和陽性對照組(P)。對組培和溫室培養(yǎng)期間的煙草葉色進(jìn)行觀察對比發(fā)現(xiàn),Ri組煙草葉色總體偏黃,為黃綠色,兩個(gè)對照組煙草葉色幾乎都是藍(lán)綠。對轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量及相關(guān)前體物質(zhì)含量分析表明,Ri組煙草葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量均顯著低于兩個(gè)對照組,說明Ri組煙草葉綠素合成受阻。且Ri組煙草葉綠素合成前體物質(zhì)ALA和PBG含量與兩個(gè)對照組沒有顯著差異,而UroⅢ含量和PBGD酶活性都顯著低于對照組,說明hemC基因是葉綠素生物合成的關(guān)鍵基因,hemC基因表達(dá)受抑,降低了 PBGD酶的活性,導(dǎo)致葉綠素的合成受阻,葉片黃化。4、2個(gè)AbhemC基因的原核表達(dá)分別構(gòu)建的2個(gè)AbhemC的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET15b-AbhemC1、2并導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中,獲得純化蛋白。對誘導(dǎo)表達(dá)的2個(gè)目的蛋白活性進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)AbHEMC1和AbHEMC2都能檢測到PBGD酶活性,其活性無顯著差異。
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因的篩選逡逑２．１試驗(yàn)材料逡逑紅苞鳳梨嵌合體植株（圖２－１Ａ）購于廣東省湛江市（２１°邋１２Ｗ，邐１１０°邋２４＇Ｅ），該逡逑研究不包括實(shí)地研究，也不涉及瀕�；蚴鼙Ｗo(hù)物種。以紅苞鳳梨短縮莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)逡逑再生得到全綠植株（圖２－１Ｂ）和全白植株（圖２－１Ｃ），將１０－１２片葉階段的健康植株葉逡逑片作為試驗(yàn)材料。生理指標(biāo)每個(gè)測定３個(gè)重復(fù)，，每個(gè)重復(fù)取自３個(gè)不同的植株。逡逑~柟蹋椋歟殄義賢跡玻焙彀錮媸匝椴牧賢煎義希疲椋紓玻卞澹粒睿幔睿幔簀澹悖錚恚錚螅酰簀澹觶幔椋猓潁幔悖簦澹幔簦酰簀澹媯錚蟈澹澹穡澹潁椋恚澹睿簦幔戾澹恚幔簦澹潁椋幔歟簀義獻(xiàn)ⅲ海ǎ粒┖彀錮媲逗咸�；（n┖彀錮孀榕嘣偕討倉輳唬ǎ茫┖彀錮孀榕嘣偕字倉輟ｅ義希危錚簦澹海ǎ粒╁澹茫瑁椋恚澹潁椋沐澹穡歟幔睿簦簀澹錚駑澹粒睿幔睿幔簀澹悖錚恚錚螅酰簀澹鰨洌猓潁幔悖簦澹幔簦酰螅澹ǎ攏╁澹茫錚恚穡歟澹簦邋澹紓潁澹澹鑠澹ǎ茫牽潁╁澹穡歟幔睿簦簀澹洌澹潁椋觶澹溴義希媯潁錚礤澹椋鑠澹觶椋簦潁镥澹悖酰歟簦酰潁邋澹錚椋粒睿幔睿幔簀澹悖錚恚錚螅酰簀澹觶洌悖悖猓潁幔悖簦澹幔簦酰螅澹ǎ茫╁澹茫錚恚穡歟澹簦邋澹鰨瑁椋簦邋澹ǎ茫祝瑁╁澹穡歟幔睿簦簀澹洌澹潁椋觶澹溴澹媯潁錚礤澹椋鑠義希觶椋簦潁镥澹悖酰歟簦酰潁邋澹錚駑澹粒睿幔睿幔簀澹悖錚恚錚螅酰簀澹觶洌蓿猓潁幔悖簦澹幔簦酰螅義希玻慘瞧魘約鈴義希玻玻敝饕瞧麇義系繾猶炱劍ǎ疲粒玻保埃矗攏蝦Ｔ狡劍⒏咚倮潿忱胄幕ǎ齲茫常叮保福遙不罩鋅浦屑眩�、辶x閑⌒屠潿忱胄幕ǎ停椋悖潁镥澹玻保遙澹裕瑁澹潁恚錚⑹院鬮濾」ǎ櫻茫玻�，邋ＴｅP潁潁澹澹穡椋睿澹螅�、蒸馆辶x纖ǎ眨校裕保玻埃

本文編號：2620799