1.異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的建立及其對(duì)CyHV-2的敏感性研究本實(shí)驗(yàn)中,我們建立了異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系,命名為GiCF。原代培養(yǎng)的GiCF細(xì)胞形態(tài)多樣,主要呈上皮樣細(xì)胞和纖維樣細(xì)胞的特點(diǎn),穩(wěn)定傳代后細(xì)胞呈纖維樣細(xì)胞的特點(diǎn)。該細(xì)胞系在20-30℃溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為25℃。染色體數(shù)目分布在140-166之間,有35%的中期分裂相的染色體縱數(shù)在156,3n=156為三倍體。用從患病異育銀鯽腎臟和脾臟中提取的病毒懸液感染GiCF細(xì)胞,7天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變現(xiàn)象,細(xì)胞收縮、變圓、脫落和細(xì)胞質(zhì)空泡化;感染9天后,病變現(xiàn)象更加明顯,出現(xiàn)大量的細(xì)胞脫落現(xiàn)象。用傳至20代的CyHV-2感染細(xì)胞,細(xì)胞病變情況更加嚴(yán)重,感染7天后,細(xì)胞大量脫落、死亡,證明GiCF細(xì)胞對(duì)CyHV-2敏感,可用于CyHV-2的增殖。另外,CyHV-2感染GiCF細(xì)胞后出現(xiàn)明顯的凋亡小體,TUNEL染色也能觀察到明顯的凋亡陽(yáng)性信號(hào),AnexinⅤ/PI染色結(jié)果表明病毒感染后發(fā)生凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著上升。說(shuō)明CyHV-2感染能引起GiCF細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。2.CyHV-2感染異育銀鯽m RNA轉(zhuǎn)錄組和小RNA轉(zhuǎn)錄組研究利用Il...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要 Abstract 引言 第一章 文獻(xiàn)綜述
1 鯉皰疹病毒II型研究進(jìn)展
    1.1 病毒學(xué)
    
1.1.1 CyHV-2的生物學(xué)特征
    
1.1.2 CyHV-2的基因組
    1.2 CyHV-2的流行特點(diǎn)
    
1.2.1 國(guó)內(nèi)外流行情況
    
1.2.2 傳播途徑
    1.3 臨床癥狀及病理特征
    1.4 CyHV-2的診斷方法
    
1.4.1 CyHV-2細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)
    
1.4.2 電鏡診斷技術(shù)
    
1.4.3 分子診斷技術(shù)
    1.5 診斷和防治
    
1.5.1 免疫相關(guān)研究進(jìn)展
    
1.5.2 疫苗與防治研究進(jìn)展
    1.6 小結(jié)
2 皰癥病毒miRNA研究進(jìn)展
    2.1 病毒miRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定
    2.2 皰疹病毒miRNA的功能
    
2.2.1 皰疹病毒miRNA影響病毒的裂解/潛伏狀態(tài)
    
2.2.2 皰疹病毒miRNA影響細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化
    
2.2.3 皰疹病毒miRNA影響腫瘤發(fā)生
    
2.2.4 皰疹病毒miRNA影響免疫反應(yīng)
    2.3 皰癥病毒miRNA研究進(jìn)展小結(jié)
3 細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展
    3.1 細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路
    
3.1.1 線粒體通路
    
3.1.2 死亡受體通路
    
3.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路
    3.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)的調(diào)控因子
    
3.2.1 Caspase家族
    
3.2.2 Bcl-2家族
    
3.2.3 ROS
    3.3 病毒感染與細(xì)胞凋亡
    
3.3.1 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞對(duì)病毒的一種防御機(jī)制
    
3.3.2 病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
    
3.3.3 病毒感染與細(xì)胞凋亡 第二章 異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的建立及其對(duì)CyHV-2的敏感性研究
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1.1 異育銀鯽
    2.1.2 病毒
    2.1.3 主要試劑和耗材
    2.1.4 儀器和設(shè)備
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2.2.1 原代及傳代培養(yǎng)
    2.2.2 最適培養(yǎng)溫度的確定
    2.2.3 細(xì)胞系物種來(lái)源鑒定
    2.2.4 核型分析
    2.2.5 CyHV-2病毒的分離
    2.2.6 CyHV-2的鑒定與滴度分析
    2.2.7 免疫熒光技術(shù)和WesternBlot檢測(cè)CyHV-2感染的GiCF細(xì)胞
    2.2.8 CyHV-2誘導(dǎo)GiCF細(xì)胞發(fā)生凋亡
    2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    2.3.1 GiCF細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)
    2.3.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
    2.3.3 細(xì)胞系物種來(lái)源鑒定
    2.3.4 細(xì)胞核型分析
    2.3.5 CyHV-2病毒的分離
    2.3.6 CyHV-2的鑒定及滴度檢測(cè)
    2.3.7 CyHV-2感染的免疫學(xué)檢測(cè)
    2.3.8 CyHV-2誘導(dǎo)GiCF細(xì)胞發(fā)生凋亡
2.4 討論
2.5 小結(jié) 第三章 CyHV-2感染異育銀鯽mRNA轉(zhuǎn)錄組和小RNA轉(zhuǎn)錄組研究
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.1.1 異育銀鯽
    3.1.2 病毒
    3.1.3 主要試劑和耗材
    3.1.4 儀器和設(shè)備
3.2 試驗(yàn)方法
    3.2.1 攻毒實(shí)驗(yàn)
    3.2.2 樣品采集
    3.2.3 總RNA的提取
    3.2.4 總RNA質(zhì)量監(jiān)控
    3.2.5 mRNA轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序
    3.2.6 smallRNA高通量測(cè)序
    3.2.7 miRNA目標(biāo)基因的預(yù)測(cè)
    3.2.8 miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    3.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3.3 結(jié)果
    3.3.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)
    3.3.2 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果分析
    3.3.3 小RNA測(cè)序結(jié)果分析
    3.3.4 miRNA長(zhǎng)度分布及表達(dá)量分析
    3.3.5 miRNA差異表達(dá)分析
    3.3.6 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及富集分析
3.4 討論
3.5 小結(jié) 第四章 CyHV-2編碼miRNA的鑒定及功能分析
4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.1.1 異育銀鯽
    4.1.2 病毒
    4.1.3 主要試劑和耗材
    4.1.4 儀器和設(shè)備
4.2 方法
    4.2.1 CyHV-2編碼miRNA的分析
    4.2.2 Stem-loopRT-qPCR法驗(yàn)證CyHV-2編碼的miRNA
    4.2.3 Northernblot驗(yàn)證CyHV-2編碼的miRNA
    4.2.4 CyHV-2感染過(guò)程病毒拷貝數(shù)定量檢測(cè)
    4.2.5 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證
    4.2.6 CyHV-2編碼miRNA靶基因預(yù)測(cè)及富集分析
    4.2.7 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2.8 突變質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2.9 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)
    4.2.10 利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA的靶基因
4.3 結(jié)果
    4.3.1 CyHV-2感染異育銀鯽過(guò)程中smallRNA測(cè)序及分析
    4.3.2 CyHV-2編碼miRNA的驗(yàn)證
    4.3.3 CyHV-2感染后腎臟中的病毒拷貝數(shù)和差異表達(dá)基因的檢測(cè)
    4.3.4 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及富集分析
    4.3.5 利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA的靶基因
4.4 討論
4.5 小結(jié) 第五章 miR-C12通過(guò)下調(diào)caspase8的表達(dá)抑制CyHV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
5.1 實(shí)驗(yàn)材料
    5.1.1 異育銀鯽
    5.1.2 病毒
    5.1.3 試劑耗材
    5.1.4 儀器設(shè)備
5.2 方法
    5.2.1 過(guò)表達(dá)miRNA對(duì)CyHV-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響
    5.2.2 miR-C12靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
    5.2.3 siRNA抑制caspase8對(duì)CyHV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
    5.2.4 Z-IETD-FMK抑制caspase8對(duì)CyHV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
    5.2.5 miR-C12抑制caspase8對(duì)CyHV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
    5.2.6 miR-C12抑制CyHV-2誘導(dǎo)的凋亡對(duì)病毒復(fù)制的影響
5.3 結(jié)果
    5.3.1 過(guò)表達(dá)miR-C12抑制CyHV-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
    5.3.2 miR-C12靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
    5.3.3 病毒感染對(duì)miR-C12和caspase8表達(dá)的影響
    5.3.4 siRNA敲降caspase8抑制CyHV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
    5.3.5 Z-IETD-FMK抑制caspase8降低CyHV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
    5.3.6 miR-C12通過(guò)降低caspase8的表達(dá)抑制CyHV-2誘導(dǎo)的凋亡
    5.3.7 miR-C12抑制CyHV-2誘導(dǎo)的凋亡促進(jìn)病毒復(fù)制
5.4 討論
5.5 小結(jié) 參考文獻(xiàn) 附錄 博士期間科研成果 致謝



本文編號(hào)：4025263