細菌外膜囊泡是革蘭氏陰細菌分泌的脂雙層球狀小泡,它能夠攜帶多種細菌毒力因子,將其轉(zhuǎn)運到細菌胞外,或者進一步轉(zhuǎn)運到宿主細胞中。因此,細菌外膜囊泡被認為是一種細菌轉(zhuǎn)運毒力因子的重要方式。殺魚愛德華氏菌是一種重要的魚類病原菌,它在感染過程中,能夠通過多種分泌系統(tǒng)將細菌毒力因子轉(zhuǎn)運到宿主細胞內(nèi),干擾宿主的免疫防御系統(tǒng),從而實現(xiàn)細菌的胞內(nèi)感染和致病過程。為了探究殺魚愛德華氏菌外膜囊泡與細菌毒力因子轉(zhuǎn)運的關(guān)系,本課題建立了殺魚愛德華氏菌外膜囊泡的提取工藝,篩選并鑒定了多個外膜囊泡轉(zhuǎn)運型細菌蛋白因子,并進一步探討了殺魚愛德華氏菌外膜囊泡的細胞內(nèi)化機制及細菌毒力因子溶血素對其內(nèi)化、胞內(nèi)小泡運輸及免疫識別的影響。具體內(nèi)容包括:首先,通過超濾濃縮和密度梯度離心的方法建立了殺魚愛德華氏菌外膜囊泡的提取工藝,通過電鏡觀察了純化外膜囊泡的形貌特征,考察了殺魚愛德華氏菌在生長過程中產(chǎn)生外膜囊泡的時相變化,并通過SDS-PAGE初步分析了殺魚愛德華氏菌外膜囊泡的蛋白組分譜;接著,利用質(zhì)譜技術(shù)對殺魚愛德華氏菌的外膜囊泡蛋白進行了蛋白組分分析,鑒定獲得了包括T3SS組件、T6SS組件、細菌鐵攝取系統(tǒng)組件、溶血素等在內(nèi)的...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 細菌的分泌系統(tǒng)
    1.2 細菌的外膜囊泡
        1.2.1 外膜囊泡的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 外膜囊泡的生物合成機制
        1.2.3 外膜囊泡的基本生物學(xué)功能
    1.3 細菌外膜囊泡分泌的毒力因子
    1.4 細菌外膜囊泡轉(zhuǎn)運不同毒力因子的鑒定方法
        1.4.1 質(zhì)譜分析法
        1.4.2 免疫印跡法
        1.4.3 免疫電鏡法
    1.5 細菌外膜囊泡的內(nèi)吞途徑和胞內(nèi)運輸
        1.5.1 細菌外膜囊泡進入宿主細胞的途徑
        1.5.2 細菌外膜囊泡在胞內(nèi)的運輸
    1.6 本課題的研究內(nèi)容及意義
第2章 殺魚愛德華氏菌外膜囊泡的提取與分析
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株
        2.2.2 藥品與試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基
        2.2.4 儀器與技術(shù)服務(wù)
    2.3 實驗方法
        2.3.1 外膜囊泡的提取
        2.3.2 Bradford法測定外膜囊泡的蛋白濃度
        2.3.3 電鏡觀察外膜囊泡
        2.3.4 外膜囊泡產(chǎn)生的動力學(xué)
        2.3.5 外膜囊泡的蛋白組分分析
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 外膜囊泡電鏡觀察
        2.4.2 密度梯度離心后外膜囊泡檢測
        2.4.3 外膜囊泡產(chǎn)生動力學(xué)
        2.4.4 外膜囊泡的蛋白組分譜分析
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
第3章 殺魚愛德華氏菌外膜囊泡分泌型細菌毒力因子的篩選
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌株與培養(yǎng)基
        3.2.2 藥品與試劑
        3.2.3 儀器與技術(shù)服務(wù)
    3.3 實驗方法
        3.3.1 質(zhì)譜分析實驗
        3.3.2 外膜囊泡分泌毒力因子免疫印跡篩選
        3.3.3 免疫印跡實驗方法
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 通過質(zhì)譜法分析外膜囊泡所攜帶的細菌毒力因子
        3.4.2 從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的效應(yīng)物中篩選依賴外膜囊泡傳遞的毒力因子
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
第4章 殺魚愛德華氏菌外膜囊泡內(nèi)吞途徑及胞內(nèi)運輸
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌株,細胞及培養(yǎng)基
        4.2.2 藥品與試劑
        4.2.3 儀器設(shè)備
    4.3 實驗方法
        4.3.1 外膜囊泡內(nèi)化免疫熒光實驗
        4.3.2 外膜囊泡內(nèi)吞抑制劑處理實驗
        4.3.3 外膜囊泡定位分析免疫熒光實驗
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 外膜囊泡隨時間的內(nèi)化過程
        4.4.2 外膜囊泡依賴dynamin的內(nèi)吞方式
        4.4.3 外膜囊泡在細胞內(nèi)的小泡運輸
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
第5章 溶血素對殺魚愛德華氏菌外膜囊泡胞內(nèi)運輸過程的影響
    5.1 引言
    5.2 實驗材料
    5.3 實驗方法
        5.3.1 溶血素過表達株免疫印跡和溶血活性鑒定實驗
        5.3.2 蛋白酶K處理外膜囊泡的實驗
        5.3.3 免疫熒光分析溶血素對外膜囊泡的內(nèi)化及胞內(nèi)運輸實驗
        5.3.4 細胞內(nèi)LPS的檢測
        5.3.5 細胞毒性LDH檢測
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 溶血素過表達菌株的鑒定
        5.4.2 溶血素在外膜囊泡中的定位
        5.4.3 溶血素對外膜囊泡內(nèi)化的影響
        5.4.4 溶血素對外膜囊泡胞內(nèi)運輸?shù)挠绊?br>        5.4.5 溶血素促進宿主caspase-4受體識別外膜囊泡中的LPS
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
論文發(fā)表
致謝



本文編號：3866449