單殖吸蟲(Monogenean)是一類常見的魚類寄生蟲,廣泛分布于世界各地淡、海水水域。常因大量寄生及其引起的繼發(fā)性疾病感染,造成幼魚大量死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。指環(huán)蟲屬(Dactylogyrus)和三代蟲屬(Gyrodactylus)是單殖吸蟲綱中物種數(shù)目最豐富、也是危害最嚴(yán)重的屬。目前,漁業(yè)生產(chǎn)中,國標(biāo)漁藥因長期、連年持續(xù)增加使用劑量引起寄生蟲的耐藥性發(fā)生,加大了單殖吸蟲病防治難度,因此,新藥的創(chuàng)制引起水產(chǎn)領(lǐng)域極大的關(guān)注。天然產(chǎn)物不僅生物活性豐富而且骨架結(jié)構(gòu)多樣,是藥物研發(fā)的理想來源。前期,本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用活性跟蹤法從藥用植物中分離鑒定出多種殺滅指環(huán)蟲的活性小分子,其中牛蒡子苷元(Arctigenin,ARG)殺蟲效果顯著、對(duì)魚類毒性低,是理想的開發(fā)成為專用殺蟲漁藥的先導(dǎo)化合物。然而,缺乏對(duì)先導(dǎo)化合物作用靶點(diǎn)和機(jī)制的研究將限制先導(dǎo)化合物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化,阻礙藥物的研發(fā)進(jìn)程。本研究首先構(gòu)建小林三代蟲(Gyrodactylus kobayashii)感染金魚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在此基礎(chǔ)上,通過ARG作用小林三代蟲形態(tài)學(xué)、RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)和iTRAQ定量蛋白組學(xué)以及利用金納米探針分...

【文章頁數(shù)】：181 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 三代蟲簡(jiǎn)介
        1.1.1 三代蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.1.2 三代蟲分類學(xué)
        1.1.3 三代蟲感染宿主免疫反應(yīng)
        1.1.4 三代蟲的危害以及防治策略
    1.2 牛蒡子苷元研究進(jìn)展
        1.2.1 殺蟲作用
        1.2.2 抗炎作用
        1.2.3 調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)
        1.2.4 降血糖
        1.2.5 抗腫瘤作用
        1.2.6 其他生物活性
    1.3 小分子化合物靶點(diǎn)鑒定方法概述
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥物靶點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用
        1.3.2 蛋白組學(xué)在靶點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用
        1.3.3 直接靶點(diǎn)鑒定方法
    1.4 金納米顆粒概述
        1.4.1 金納米粒子的制備
        1.4.2 金納米粒子表面修飾
        1.4.3 金納米粒子在藥物靶點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用
    1.5 選題目的和意義
第二章 小林三代蟲感染金魚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?br>    2.1 材料與方法
        2.1.1 動(dòng)物和藥品
        2.1.2 試劑和儀器
        2.1.3 無蟲金魚的獲得
        2.1.4 小林三代蟲純化培養(yǎng)
        2.1.5 三代蟲的種類鑒定
        2.1.6 小林三代蟲保種
        2.1.7 酶切法快速鑒定金魚三代蟲種類
        2.1.8 金魚對(duì)小林三代蟲感染的免疫應(yīng)答
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 寄生金魚三代蟲種類
        2.2.2 小林三代蟲形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果
        2.2.3 小林三代蟲分子生物學(xué)鑒定結(jié)果
        2.2.4 酶切法鑒定小林三代蟲-金魚模型純化結(jié)果
        2.2.5 金魚對(duì)小林三代蟲感染的免疫應(yīng)答
    2.3 討論
        2.3.1 小林三代蟲是自然感染金魚優(yōu)勢(shì)種類
        2.3.2 小林三代蟲感染金魚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煞�(wěn)定傳代
        2.3.3 細(xì)胞因子的表達(dá)與清除三代蟲感染有關(guān)
    2.4 小結(jié)
第三章 牛蒡子苷元安全性評(píng)價(jià)及作用小林三代蟲形態(tài)學(xué)研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 試驗(yàn)藥品
        3.1.3 試劑和儀器
        3.1.4 殺蟲活性評(píng)價(jià)
        3.1.5 金魚安全性評(píng)價(jià)
        3.1.6 ARG對(duì)三代蟲活動(dòng)能力的影響
        3.1.7 ARG對(duì)三代蟲超微結(jié)構(gòu)的影響
        3.1.8 ARG對(duì)三代蟲肌肉結(jié)構(gòu)的影響
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 ARG殺蟲活性
        3.2.2 ARG對(duì)金魚的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果
        3.2.3 ARG處理后三代蟲作用癥狀
        3.2.4 三代蟲表皮超微結(jié)構(gòu)變化
        3.2.5 三代蟲內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)變化
        3.2.6 肌肉結(jié)構(gòu)損傷結(jié)果
    3.3 討論
        3.3.1 ARG顯示較低的毒性
        3.3.2 ARG顯示新穎的殺滅三代蟲機(jī)制
        3.3.3 ARG殺蟲機(jī)制與表皮破壞和呼吸抑制有關(guān)
    3.4 小結(jié)
第四章 牛蒡子苷元對(duì)小林三代蟲轉(zhuǎn)錄組水平的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試動(dòng)物
        4.1.2 試驗(yàn)藥品
        4.1.3 試劑和儀器
        4.1.4 小林三代蟲的培養(yǎng)
        4.1.5 ARG藥浴三代蟲的收集
        4.1.6 總RNA提取及定量
        4.1.7 cDNA文庫的構(gòu)建、質(zhì)量檢測(cè)及測(cè)序
        4.1.8 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝和注釋
        4.1.9 基因差異表達(dá)分析
        4.1.10 GO和 KEGG網(wǎng)絡(luò)富集分析
        4.1.11 qRT-PCR驗(yàn)證
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 ARG藥浴的三代蟲活動(dòng)能力和存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果
        4.2.2 總RNA質(zhì)量檢測(cè)
        4.2.3 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)
        4.2.4 轉(zhuǎn)錄本拼接統(tǒng)計(jì)
        4.2.5 基因功能注釋
        4.2.6 基因差異表達(dá)分析
        4.2.7 差異表達(dá)基因GO富集分析
        4.2.8 差異表達(dá)基因KEGG富集分析
        4.2.9 差異表達(dá)基因韋恩圖分析
        4.2.10 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果
    4.3 討論
        4.3.1 三代蟲來源的RNA篩選方法可靠
        4.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得大量三代蟲基因信息
        4.3.3 ARG殺蟲作用于體壁結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)
        4.3.4 ARG藥浴引起三代蟲能量代謝紊亂
    4.4 小結(jié)
第五章 牛蒡子苷元作用小林三代蟲蛋白質(zhì)組比較研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 供試動(dòng)物
        5.1.2 試劑和儀器
        5.1.3 主要試劑配制
        5.1.4 ARG藥浴三代蟲的收集
        5.1.5 iTRAQ蛋白定量
        5.1.6 蛋白質(zhì)定量和差異蛋白GO、KEGG通路富集分析
        5.1.7 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        5.1.8 qRT-PCR分析
        5.1.9 ATP含量檢測(cè)
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 蛋白質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
        5.2.2 蛋白質(zhì)鑒定信息
        5.2.3 蛋白質(zhì)COG功能注釋
        5.2.4 差異表達(dá)蛋白鑒定與分析
        5.2.5 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
        5.2.6 ARG對(duì)三代蟲ATP酶以及呼吸鏈復(fù)合物基因表達(dá)的影響
        5.2.7 ARG對(duì)小林三代蟲ATP含量的影響
    5.3 討論
        5.3.1 iTRAQ技術(shù)為研究ARG的殺蟲機(jī)制奠定基礎(chǔ)
        5.3.2 ARG作用下小林三代蟲差異蛋白分析
    5.4 小結(jié)
第六章 利用金納米探針鑒定牛蒡子苷元作用小林三代蟲靶點(diǎn)
    6.1 材料與方法
        6.1.1 供試動(dòng)物
        6.1.2 試劑與儀器
        6.1.3 化合物2 的合成與殺蟲活性評(píng)價(jià)
        6.1.4 化合物6和10 的設(shè)計(jì)與合成
        6.1.5 金納米探針GNP-6和GNP-10 的合成
        6.1.6 金納米探針透射電鏡觀察
        6.1.7 傅立葉變換紅外光譜檢測(cè)
        6.1.8 HPLC-MS/MS定量配體
        6.1.9 金納米探針蟲體攝取的電鏡觀察
        6.1.10 金納米探針離體殺蟲活性評(píng)價(jià)
        6.1.11 小林三代蟲裂解液的準(zhǔn)備
        6.1.12 靶點(diǎn)蛋白的鑒定
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 化合物1-10 的結(jié)構(gòu)表征
        6.2.2 化合物2 在體作用小林三代蟲活性
        6.2.3 金納米探針形貌觀察和粒徑分布
        6.2.4 金納米探針傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)
        6.2.5 金納米探針的表面配體定量
        6.2.6 金納米探針蟲體定位研究及殺蟲活性評(píng)價(jià)
        6.2.7 化合物1 的靶點(diǎn)鑒定
    6.3 討論
        6.3.1 MyosinⅡ是ARG作用小林三代蟲直接靶點(diǎn)
        6.3.2 肌球蛋白是一類重要的藥物驅(qū)蟲靶點(diǎn)
    6.4 小結(jié)
第七章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3835071