甲狀腺素(thyroid hormone,TH)是一類氨基酸衍生物,在個(gè)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞增殖和分化等方面均有廣泛的作用。牙鲆(Paralichthys olivaceus)在我國是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類,其從仔魚到稚魚的轉(zhuǎn)變中經(jīng)歷一個(gè)劇烈的變態(tài)發(fā)育過程,伴隨著身體對稱性的失去和眼睛的移位等等,該過程受甲狀腺素的調(diào)控。業(yè)已證實(shí),甲狀腺素通過甲狀腺素受體(thyroid hormone receptor,TR)誘導(dǎo)加速牙鲆仔魚的變態(tài)。但到目前為止,關(guān)于甲狀腺素調(diào)控仔魚變態(tài)的機(jī)制知之甚少。本文從三個(gè)方面展開研究,主要結(jié)果如下:1、牙鲆變態(tài)過程中甲狀腺素受體和脫碘酶表達(dá)的關(guān)系為研究外源性TH對牙鲆變態(tài)期間脫碘酶和甲狀腺素受體的影響,筆者將15 dph(15 days post hatch,出膜后15天)的仔魚隨機(jī)分成3組:正常對照組(normal control,NC)、TH處理組和TU(thiourea,硫脲)處理組,飼養(yǎng)直至41 dph。為了評估用TU處理的牙鲆是否可以通過外源性TH來拯救其變態(tài),筆者在35 dph(NC組牙鲆已經(jīng)完成變態(tài))時(shí)設(shè)計(jì)了拯救實(shí)驗(yàn),將TU組的幼體分...

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要中英文縮略詞表
第一章 引言
    1 甲狀腺素
        1.1 甲狀腺素的發(fā)現(xiàn)
        1.2 甲狀腺素的合成和分泌
        1.3 甲狀腺素的生理作用
        1.4 甲狀腺素的作用機(jī)制和甲狀腺素受體的發(fā)現(xiàn)
    2 甲狀腺素受體
        2.1 甲狀腺素受體的結(jié)構(gòu)和分類
        2.2 甲狀腺素受體在組織和細(xì)胞中的分布
        2.3 甲狀腺素受體的生理功能
            2.3.1 TR的基因受體作用
            2.3.2 TR的非基因受體作用
        2.4 甲狀腺素受體的共作用因子
    3 甲狀腺素和甲狀腺素受體在魚類早期發(fā)育中的作用
    4 研究目的和意義
第二章 牙鲆變態(tài)過程中甲狀腺素受體與脫碘酶表達(dá)的關(guān)系
    1 材料與方法
        1.1 動物實(shí)驗(yàn)和取樣
        1.2 試驗(yàn)試劑
        1.3 試劑的配制
        1.4 主要試驗(yàn)器材
        1.5 試驗(yàn)方法
            1.5.1 總RNA的提取
            1.5.2 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA
            1.5.3 引物設(shè)計(jì)
            1.5.4 熒光定量PCR
            1.5.5 四碘甲狀腺原氨酸T4和三碘甲狀腺原氨酸T3的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
    2 試驗(yàn)結(jié)果
        2.1 總RNA的提取和鑒定
        2.2 牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中脫碘酶在體內(nèi)的表達(dá)
        2.3 牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中體內(nèi)甲狀腺素受體的表達(dá)
        2.4 變態(tài)期間牙鲆體內(nèi)T4和T3整體水平的變化
        2.5 外源TH處理及其對牙鲆脫碘酶和甲狀腺素受體表達(dá)的影響
        2.6 TU處理組牙鲆的變態(tài)拯救
    3 討論
        3.1 脫碘酶和甲狀腺素受體在牙鲆變態(tài)過程中的表達(dá)
        3.2 外源TH和TU處理對牙鲆變態(tài)過程中脫碘酶和甲狀腺素受體表達(dá)水平的影響
        3.3 變態(tài)拯救
第三章 甲狀腺素受體結(jié)合蛋白的鑒定及其受甲狀腺素調(diào)控的變化
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)試劑
        1.2 試驗(yàn)主要器材
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.3.2 牙鲆TRβ多克隆抗體的制備
            1.3.3 TRβ在牙鲆胚胎細(xì)胞中的過表達(dá)
                1.3.3.1 TRβmRNA編碼區(qū)(CDS)全序列的擴(kuò)增
                1.3.3.2 雙酶切
                1.3.3.3 連接及轉(zhuǎn)化
                1.3.3.4 重組質(zhì)粒的鑒定和擴(kuò)增抽提
                1.3.3.5 pEGFP-N1-TRβ轉(zhuǎn)染細(xì)胞
                1.3.3.6 RT-qPCR及WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TRβ的表達(dá)
            1.3.4 免疫沉淀
            1.3.5 WesternBlot檢測IP復(fù)合物
            1.3.6 質(zhì)譜檢測IP復(fù)合物
            1.3.7 RT-qPCR分析TRβ候選相互作用蛋白的mRNA在牙鲆變態(tài)過程中的表達(dá)及其對外源激素處理的反應(yīng)
    2 試驗(yàn)結(jié)果
        2.1 牙鲆TRβ多克隆抗體的制備
            2.1.1 TRβ多克隆抗體的質(zhì)量檢驗(yàn)
            2.1.2 TRβ多克隆抗體用于牙鲆組織蛋白和胚胎細(xì)胞蛋白的WesternBlot分析
        2.2 TRβ在牙鲆胚胎細(xì)胞中的過表達(dá)
            2.2.1 牙鲆TRβ真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.2 pEGFP-N1-TRβ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牙鲆胚胎細(xì)胞
            2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染牙鲆胚胎細(xì)胞中TRβ的表達(dá)
        2.3 免疫沉淀
            2.3.1 WesternBlot檢測免疫沉淀復(fù)合物
            2.3.2 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜法檢測IP復(fù)合物
            2.3.3 可信蛋白在牙鲆變態(tài)過程中的表達(dá)及其對外源激素刺激的反應(yīng)
    3 討論
第四章 牙鲆變態(tài)過程中蛋白質(zhì)組受外源性甲狀腺素影響的變化
    1 材料與方法
        1.1 動物試驗(yàn)和采樣
        1.2 試驗(yàn)試劑
        1.3 試驗(yàn)試劑的配制
        1.4 試驗(yàn)主要器材
        1.5 試驗(yàn)方法
            1.5.1 制備蛋白質(zhì)樣品并用TMT試劑標(biāo)記
            1.5.2 肽段混合物的高效液相色譜分離
            1.5.3 LC-MS/MS在線分析肽段混合物
            1.5.4 數(shù)據(jù)處理和分析
            1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡
            1.5.6 生物信息學(xué)分析
    2 試驗(yàn)結(jié)果
        2.1 試驗(yàn)魚的生長狀態(tài)
        2.2 通過TMT定量分析鑒定的TH處理和自然發(fā)育的牙鲆之間差異表達(dá)的蛋白
        2.3 差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位
        2.4 通過定量實(shí)時(shí)PCR和Western印跡驗(yàn)證差異表達(dá)的蛋白質(zhì)
        2.5 通過GO和KEGG通路富集分析評估差異表達(dá)的蛋白質(zhì)
        2.6 蛋白互作分析
    3 討論
總結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3810387