短蛸(Octopus ocellatus)是我國沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)品種,針對日益嚴(yán)峻的水產(chǎn)養(yǎng)殖形勢和海洋生態(tài)問題,迫切需要從分子水平了解短蛸免疫機(jī)制,探討提高其抗病力的途徑,改進(jìn)種質(zhì)資源的品質(zhì),為海洋生態(tài)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展提供理論支持。短蛸缺乏獲得性免疫,在抵御微生物侵襲時主要依賴固有免疫系統(tǒng)。溶菌酶作為重要的免疫效應(yīng)因子,在機(jī)體免疫防御反應(yīng)中可以直接抵抗病原微生物,也可以誘導(dǎo)機(jī)體合成和分泌其他免疫因子。溶菌酶通過水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵裂解不溶性的肽聚糖,使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂起到殺菌作用。依據(jù)來源和結(jié)構(gòu)的不同將溶菌酶分為六大類型:c型、g型、植物型、細(xì)菌型、噬菌體型和i型,其中i型溶菌酶作為無脊椎動物所特有的一種溶菌酶主要分布在環(huán)節(jié)動物門、棘皮動物門、軟體動物門和節(jié)肢動物門中。本研究以課題組已構(gòu)建的短蛸c DNA文庫為基礎(chǔ),運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得短蛸i型溶菌酶(Oo Lys)基因;對該基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;檢測了Oo Lys在短蛸各組織及其受到鰻弧菌和藤黃微球菌刺激后在血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律;利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了以大腸桿菌BL21(...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 海洋貝類先天性免疫
    1.2 海洋貝類的免疫防御機(jī)制
        1.2.1 細(xì)胞免疫
        1.2.2 體液免疫
            1.2.2.1 凝集素
            1.2.2.2 抗菌肽
            1.2.2.3 溶酶體酶
            1.2.2.4 化學(xué)遞質(zhì)
    1.3 免疫防御過程
        1.3.1 免疫識別
            1.3.1.1 病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns， PAMPs)
            1.3.1.2 模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)
        1.3.2 免疫信號的傳導(dǎo)
            1.3.2.1 Toll/dif途徑
            1.3.2.2 Imd/Relish途徑
        1.3.3 病原體的清除(Pathogen elimination)
    1.4 溶菌酶的分類和功能
        1.4.1 溶菌酶的分類
            1.4.1.1 c型溶菌酶
            1.4.1.2 g型溶菌酶
            1.4.1.3 i型溶菌酶
        1.4.2 溶菌酶的功能
            1.4.2.1 溶菌酶的免疫功能
            1.4.2.2 溶菌酶的消化功能
    1.5 本研究的目的和意義
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 研究的意義
第二章 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的克隆及表達(dá)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的c DNA全長克隆
        2.2.2 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的序列分析
        2.2.3 短蛸總RNA的提取和c DNA的合成
            2.2.3.1 組織的采集
            2.2.3.2 總RNA的提取
            2.2.3.3 c DNA的合成
        2.2.4 Oo Lys定量引物的設(shè)計
        2.2.5 短蛸不同組織Oo Lys的m RNA的表達(dá)分析
        2.2.6 鰻弧菌和藤黃微球菌刺激后Oo Lys的m RNA在血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 Oo Lys的c DNA全長及氨基酸序列特征
        2.3.2 Oo Lys的同源分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建
        2.3.3 Oo Lys的三級結(jié)構(gòu)
        2.3.4 Oo Lys的m RNA在各組織中的表達(dá)規(guī)律
        2.3.5 細(xì)菌刺激后Oo Lys的m RNA在血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律
    2.4 討論
第三章 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的純化復(fù)性
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和引物
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Oo Lys目的片段的獲取
        3.2.2 切膠回收
        3.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.4 質(zhì)粒抽提
        3.2.5 Oo Lys基因的表達(dá)轉(zhuǎn)化
        3.2.6 重組蛋白的表達(dá)與檢測
        3.2.7 重組蛋白的純化
        3.2.8 重組蛋白的復(fù)性和濃度測定
            3.2.8.1 重組蛋白的復(fù)性
            3.2.8.2 重組蛋白的濃縮和濃度測定
        3.2.9 多克隆抗體的制備
        3.2.10 多克隆抗體特異性的檢測
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 原核表達(dá)系統(tǒng)
        3.3.2 純化與復(fù)性的r Oo Lys
    3.4 討論
第四章 rOo Lys的活性分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 r Oo Lys的溶菌活性分析
        4.2.2 熱處理r Oo Lys后的溶菌活性分析
        4.2.3 r Oo Lys的胞壁酸酶活性分析
        4.2.4 r Oo Lys對鰻弧菌的抑菌作用分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 r Oo Lys的溶菌活性
        4.3.2 熱處理后r Oo Lys的活性
        4.3.3 r Oo Lys的胞壁酸酶活性
        4.3.4 r Oo Lys對鰻弧菌的抑菌作用
    4.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
已完成文章
項(xiàng)目支持
致謝



本文編號：3779409