淋巴囊腫病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）是魚類淋巴囊腫病的病原，呈世界性分布，可感染42科140種以上的淡水、半咸水和海水魚類。該病自1997年在我國山東威海地區(qū)的養(yǎng)殖牙鲆中首次暴發(fā)以來，迅速蔓延至遼寧、河北、浙江等沿海省份，給我國的魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒，囊膜病毒通過囊膜上的單個(gè)或多個(gè)黏附蛋白與宿主靶細(xì)胞上的受體蛋白發(fā)生特異性結(jié)合而吸附到靶細(xì)胞表面，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞上的蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，促進(jìn)宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜融合，使病毒的遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行復(fù)制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白對于闡明病毒感染和致病的分子機(jī)制具有重要意義。 實(shí)驗(yàn)室前期曾在牙鲆（Paralichthys olivaceus）鰓細(xì)胞（FG）上鑒定出一個(gè)分子量為27.8kDa的LCDV細(xì)胞受體蛋白，并制備了2株抗27.8kDa受體蛋白的單克隆抗體（2G11、3D9），2株抗體都能有效阻斷LCDV對FG細(xì)胞的感染。應(yīng)用抗27.8kDa受體蛋白單克隆抗體與Far-western技術(shù)在LCDV上發(fā)現(xiàn)一個(gè)分子量為32kDa的蛋白能夠與27.8kDa受體...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 魚類淋巴囊腫病的研究進(jìn)展
        1.1.1 淋巴囊腫病毒流行病學(xué)研究
        1.1.2 淋巴囊腫病毒病理學(xué)研究
        1.1.3 淋巴囊腫病毒結(jié)構(gòu)研究
        1.1.4 淋巴囊腫病的生物分子學(xué)研究
        1.1.5 淋巴囊腫病毒病的預(yù)防與治療
    1.2 囊膜病毒侵染機(jī)制的研究進(jìn)展
        1.2.1 病毒囊膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.2 囊膜病毒的侵染機(jī)制
    1.3 蛋白表達(dá)系統(tǒng)及純化技術(shù)簡述
        1.3.1 蛋白質(zhì)純化技術(shù)
        1.3.2 蛋白的表達(dá)系統(tǒng)
2 淋巴囊腫病毒 32kDa 囊膜蛋白的原核表達(dá)及其多抗制備
    2.1 材料與方法
        2.1.1 淋巴囊腫病毒的提純
        2.1.2 淋巴囊腫病毒 DNA 的提取及 ORF038 基因表達(dá)引物的設(shè)計(jì)
        2.1.3 ORF038 基因片段的擴(kuò)增、純化及雙酶切
        2.1.4 ORF038 基因與 pET32a 雙酶切
        2.1.5 連接、轉(zhuǎn)化與陽性菌株檢測
        2.1.6 表達(dá)載體的菌落 PCR 及雙酶切檢測
        2.1.7 表達(dá)載體 pET32a-ORF038 在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.1.8 SDS-PAGE 檢測重組菌表達(dá)情況
        2.1.9 ORF038 重組表達(dá)蛋白的純化
        2.1.10 多克隆抗體的制備
        2.1.11 ELISA 檢測 ORF038 重組蛋白與多抗的結(jié)合
        2.1.12 Western-blot 檢測多抗與重組表達(dá)蛋白及 LCDV 蛋白結(jié)合
        2.1.13 淋巴囊腫病毒 32kDa 蛋白的免疫電鏡定位
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 淋巴囊腫病毒粒子的純化
        2.2.2 LCDV-ORF038 目的片段的擴(kuò)增
        2.2.3 pET32a-ORF038 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切檢測
        2.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化
        2.2.5 多抗與 LCDV ORF038 重組表達(dá)蛋白的結(jié)合
        2.2.6 多抗與重組表達(dá)蛋白及 LCDV 蛋白的結(jié)合
        2.2.7 ORF038 蛋白的免疫電鏡結(jié)果
    2.3 討論
3 LCDV ORF038 重組蛋白與受體蛋白的相互作用
    3.1 材料與方法
        3.1.1 牙鲆鰓細(xì)胞膜蛋白的提取
        3.1.2 阻斷 ELISA 實(shí)驗(yàn)
        3.1.3 FITC 熒光素標(biāo)記的 ORF038 重組表達(dá)蛋白的制備
        3.1.4 免疫熒光技術(shù)檢測 ORF038 重組表達(dá)蛋白與 FG 細(xì)胞的結(jié)合
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 ORF038 重組表達(dá)蛋白阻斷實(shí)驗(yàn)
        3.2.2 LCDV ORF038 重組表達(dá)蛋白與 FG 細(xì)胞結(jié)合的免疫熒光結(jié)果
    3.3 討論
4 淋巴囊腫病毒 32kDa 黏附蛋白在感染 FG 細(xì)胞中的作用
    4.1 材料與方法
        4.1.1 FG 細(xì)胞的體外培養(yǎng)
        4.1.2 病毒體外感染中和實(shí)驗(yàn)
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 FG 細(xì)胞的培養(yǎng)狀況
        4.2.2 抗 ORF038 重組蛋白多抗抑制 LCDV 侵染 FG 細(xì)胞
    4.3 討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷
碩士期間發(fā)表文章



本文編號：3754501