日本沼蝦,俗稱青蝦,是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類。隨著青蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,環(huán)境脅迫問(wèn)題日益凸顯,而氨氮是青蝦養(yǎng)殖中最重要的環(huán)境脅迫因子,能夠嚴(yán)重影響青蝦生長(zhǎng)發(fā)育與生理健康。因此,研究青蝦抗氨氮脅迫的分子機(jī)制,不但能為提高蝦類的抗病力和免疫力提供理論依據(jù),也能為保護(hù)青蝦的種質(zhì)資源和培育抗逆品種奠定基礎(chǔ)。本研究在實(shí)驗(yàn)室人為創(chuàng)造可控制氨氮脅迫環(huán)境,將青蝦飼養(yǎng)于高氨氮濃度(22.1mg/L)的環(huán)境下,從脅迫48h時(shí)依然成活的青蝦個(gè)體中,隨機(jī)選擇活潑的個(gè)體,提取其肝胰腺,與正常飼養(yǎng)條件下的對(duì)照組蝦同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、代謝組高通量測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)差異基因顯著富集于補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路中。代謝組篩選到尿素、尿酸與青蝦抵抗氨氮脅迫性狀密切相關(guān),進(jìn)一步從補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路中選擇絲氨酸蛋白酶抑制因子(Mn-SPI)基因進(jìn)行了克隆與組織表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下:(1)轉(zhuǎn)錄組分析,采用Illumina測(cè)序平臺(tái)HiSeq4000進(jìn)行雙末端測(cè)序,共得到183,877,174條原始測(cè)序序列,其錯(cuò)誤率僅為0.01%。對(duì)此粗讀本進(jìn)行過(guò)...

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 日本沼蝦及其養(yǎng)殖現(xiàn)狀
    1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)展與應(yīng)用
        1.2.1 轉(zhuǎn)錄組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)
        1.2.2 第二代測(cè)序技術(shù)
            1.2.2.1454 焦磷酸法平臺(tái)
            1.2.2.2 Solexa基因組分析儀
            1.2.2.3 SOLiD高通量測(cè)序儀
            1.2.2.4 LifeTechnologie平臺(tái)
            1.2.2.5 BGISEQ-500平臺(tái)
    1.3 代謝組學(xué)
        1.3.1 代謝組學(xué)研究技術(shù)
        1.3.2 常用數(shù)據(jù)采集方法
            1.3.2.1 核磁共振技術(shù)
            1.3.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜
            1.3.2.3 液相色譜-質(zhì)譜
            1.3.2.4 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜
    1.4 水體環(huán)境因子對(duì)甲殼動(dòng)物影響的研究
    1.5 氨氮來(lái)源與危害
        1.5.1 水體中氨氮的來(lái)源
        1.5.2 氨氮對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的危害
        1.5.3 甲殼動(dòng)物在氨氮脅迫下解毒代謝機(jī)制
    1.6 補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路
        1.6.1 絲氨酸蛋白酶抑制劑
        1.6.2 酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的絲氨酸蛋白酶抑制劑
        1.6.3 Serpin家族
    1.7 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 常用溶液配制
        2.1.5 主要數(shù)據(jù)庫(kù)及生物軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 納氏試劑法測(cè)定實(shí)驗(yàn)用水氨氮含量
            2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
            2.2.1.2 水樣測(cè)定
        2.2.2 氨氮脅迫試驗(yàn)
        2.2.3 日本沼蝦肝胰腺RNA提取
            2.2.3.1 前期準(zhǔn)備工作
            2.2.3.2 總RNA提取及其純化
        2.2.4 RNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)
        2.2.5 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
        2.2.6 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建、庫(kù)檢及上機(jī)測(cè)序
        2.2.7 代謝組實(shí)驗(yàn)方案
        2.2.8 引物合成
        2.2.9 Mn-SPI基因的克隆
        2.2.10 PCR產(chǎn)物片段回收
        2.2.11 PCR產(chǎn)物與載體的連接
        2.2.12 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及測(cè)序
        2.2.13 生物信息學(xué)分析
        2.2.14 熒光定量PCR
3 結(jié)果與分析
    3.1 RNA的提取及其質(zhì)量檢測(cè)
        3.1.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
        3.1.2 核酸分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果
        3.1.3 RNA毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果
    3.2 Illumina測(cè)序和序列組裝結(jié)果
        3.2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)及質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估結(jié)果
        3.2.2 Illumina測(cè)序結(jié)果
        3.2.3 Trinity拼接結(jié)果
        3.2.4 基因功能注釋
        3.2.5 Unigene的GO分類結(jié)果
        3.2.6 Unigene的KOG分類
        3.2.7 Unigene的KEGG分類
        3.2.8 基因差異表達(dá)分析
        3.2.9 差異基因KEGG富集分析
        3.2.10 差異基因熒光定量驗(yàn)證
    3.3 青蝦Mn-SPI基因的克隆與表達(dá)分析
        3.3.1 青蝦Mn-SPI基因完整ORF的克隆結(jié)果及分析
        3.3.2 青蝦Mn-SPI基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析
            3.3.2.1 氨基酸序列分析
            3.3.2.2 Mn-SPI蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)
            3.3.2.3 Mn-SPI蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)
            3.3.2.4 Mn-SPI蛋白的功能域分析
            3.3.2.5 Mn-SPI蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.3.3 Mn-SPI差異表達(dá)規(guī)律
    3.4 氨氮脅迫后青蝦代謝組分析
        3.4.1 數(shù)據(jù)前處理和代謝物注釋
        3.4.2 主成分分析(PCA)
        3.4.3 偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)
        3.4.4 熱圖分析
        3.4.5 差異代謝物統(tǒng)計(jì)
4 討論
    4.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與抗氨氮脅迫免疫相關(guān)通路
    4.2 氨氮脅迫對(duì)青蝦代謝物的影響
    4.3 轉(zhuǎn)錄組與代謝組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3745093