為了研究尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)蛋白激酶C theta(PKCθ)和Spartin的蛋白表達(dá)情況,本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)和提純了尼羅羅非魚PKCθ和Spartin的重組蛋白,并利用日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)制備了相應(yīng)的多克隆抗體。用間接ELISA技術(shù)檢測(cè)抗體效價(jià),Western Blot鑒定抗體的特異性,并檢測(cè)其在羅非魚肝、脾、腸和肌肉組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體p ET-B2m-PKCθ和pET-B2m-Spartin,實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的原核表達(dá)和純化。PKCθ重組蛋白主要存在于包涵體中,分子量約為56 ku;Spartin重組蛋白分子量約為30 ku,以包涵體蛋白的形式存在。獲得的多克隆抗體效價(jià)均高達(dá)1︰512 000,Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,制備的抗體能特異性識(shí)別尼羅羅非魚PKCθ和Spartin多種異構(gòu)體;PKCθ蛋白在羅非魚肝、脾、腸與肌肉組織中均有表達(dá);Spartin蛋白在羅非魚的肝、脾和腸組織中不表達(dá),在肌肉組織中表達(dá)。研究表明,尼羅羅非...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 PKCθ和Spartin基因擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
    1.2 重組蛋白的表達(dá)和純化
    1.3 蛋白結(jié)構(gòu)分析和抗原預(yù)測(cè)
    1.4 多克隆抗體制備和效價(jià)檢測(cè)
    1.5 抗體特異性的Western Blot分析
    1.6 抗體純化
2 結(jié)果
    2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果
    2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化
    2.3 跨膜區(qū)和抗原性分析
    2.4 多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)
    2.5 抗體特異性檢測(cè)結(jié)果
    2.6 抗體純化結(jié)果
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