鯽（Carassius auratus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一,在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。鯽造血器官壞死癥是目前危害養(yǎng)殖鯽最為嚴重的病毒性疾病,其病原為鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）。鯽造血器官壞死癥流行范圍廣、傳染性強,死亡率高,給鯽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。目前,鯽造血器官壞死癥尚缺乏有效的防控和治療方法。疫苗免疫被認為是預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖動物傳染性疾病特別是病毒性疾病最為有效的方法。鯉皰疹病毒II型細胞疫苗制備主要以細胞瓶貼壁方式培養(yǎng)病毒,是疫苗規(guī)�；a(chǎn)的瓶頸因素,探索鯽腦組織細胞（GiCB）與鯉皰疹病毒II型規(guī)�；囵B(yǎng)工藝具有潛在的應(yīng)用前景。本論文針對鯉皰疹病毒II型細胞疫苗規(guī)模化制備與應(yīng)用過程中存在的關(guān)鍵工藝問題,開展了鯽腦組織細胞與鯉皰疹病毒II型微載體培養(yǎng)技術(shù)及其滅活疫苗浸泡免疫效果的研究,旨在為鯽造血器官壞死癥的有效防控提供新的技術(shù)途徑。本論文主要研究內(nèi)容如下:1、研究了在Cephodex微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中規(guī)�；囵B(yǎng)鯽腦組織細胞和鯉皰疹病毒II型的工藝。結(jié)果表明,Cephodex微載體適合GiCB細胞的貼壁培養(yǎng),... 

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要 ABSTRACT 第一章 文獻綜述
1 鯉皰疹病毒II型研究進展
    1.1 鯽養(yǎng)殖現(xiàn)狀
    1.2 鯽造血器官壞死癥的臨床癥狀及其流行病學(xué)研究
    
1.2.1 鯽造血器官壞死癥的臨床癥狀
    
1.2.2 鯽造血器官壞死癥的流行病學(xué)研究
    
    1.2.2.1 流行區(qū)域
    
    1.2.2.2 宿主范圍
    
    1.2.2.3 傳播方式
    
    1.2.2.4 流行季節(jié)
    1.3 鯉皰疹病毒II型的理化和生物學(xué)特性
    1.4 鯉皰疹病毒II型的診斷技術(shù)
    
1.4.1 電鏡診斷技術(shù)
    
1.4.2 細胞培養(yǎng)分離法
    
1.4.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)
    1.5 鯽造血器官壞死癥的防治措施
    
1.5.1 藥物防治
    
1.5.2 免疫預(yù)防
    
1.5.3 生態(tài)防控
2 微載體培養(yǎng)技術(shù)研究進展
    2.1 微載體培養(yǎng)的發(fā)明與發(fā)展
    2.2 微載體的分類與特點
    2.3 微載體培養(yǎng)的問題與展望
3 漁用疫苗的研究
    3.1 漁用疫苗的發(fā)展
    3.2 疫苗的分類
    3.3 疫苗的免疫途徑
    
3.3.1 注射免疫
    
3.3.2 浸泡免疫
    
3.3.3 口服免疫
4 本論文研究的目的及意義 第二章 鯽腦組織細胞與鯉皰疹病毒II型微載體規(guī)�；囵B(yǎng)工藝研究
1 材料與方法
    1.1 實驗材料
    
1.1.1 細胞與病毒
    
1.1.2 實驗試劑
    
1.1.3 實驗儀器與設(shè)備
    1.2 試驗方法
    
1.2.1 種子細胞與病毒培養(yǎng)
    
1.2.2 Cephodex微載體預(yù)處理
    
1.2.3 微載體培養(yǎng)GiCB細胞
    
1.2.4 最適間歇攪拌條件的確定
    
1.2.5 血清濃度對CIK細胞貼壁的影響
    
1.2.6 最適微載體用量的確定
    
1.2.7 最適細胞接種濃度的確定
    
1.2.8 最適攪拌速度的確定
    
1.2.9 細胞形態(tài)觀察與計數(shù)
    
1.2.10 病毒感染及電鏡觀察
    
1.2.11 病毒增殖曲線的測定
    
1.2.12 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 GiCB細胞靜置培養(yǎng)的形態(tài)及病變效應(yīng)
    2.2 最適間歇攪拌條件的確定
    2.3 血清的濃度對GiCB細胞貼壁的影響
    2.4 微載體濃度對細胞生長的影響
    2.5 接種密度對GiCB細胞生長的影響
    2.6 攪拌速度對GiCB細胞生長的影響
    2.7 GiCB細胞在Cephodex微載體上的形態(tài)觀察
    2.8 病毒感染與電鏡觀察
    2.9 病毒滴度測定結(jié)果
    2.10 病毒增殖曲線測定
3 討論 第三章 CYHV-2 微載體細胞培養(yǎng)滅活疫苗浸泡免疫異育銀鯽效果研究
1 材料與方法
    1.1 實驗材料
    
1.1.1 試驗魚及飼養(yǎng)條件
    
1.1.2 病毒及細胞系
    
1.1.3 實驗試劑
    
1.1.4 實驗儀器與設(shè)備
    
1.1.5 引物設(shè)計
    1.2 實驗方法
    
1.2.1 微載體細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備
    
1.2.2 疫苗的無菌檢驗與安全性檢測
    
1.2.3 浸泡免疫
    
1.2.4 Real-time PCR檢測免疫相關(guān)基因表達量
    
1.2.5 攻毒感染實驗
    
    1.2.5.1 免疫4周后攻毒感染實驗
    
    1.2.5.2 免疫8周后攻毒感染實驗
    
1.2.6 實驗魚體病毒檢測
    
1.2.7 實驗魚體病毒載量測定
    1.3 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 疫苗的無菌檢驗與安全性檢驗
    2.2 C3、IL-11 和IgM基因的表達量變化
    2.3 免疫保護效果
    
2.3.1 免疫4周后攻毒感染實驗
    
2.3.2 免疫8周后攻毒感染實驗
    2.4 PCR病毒檢測結(jié)果
    2.5 免疫魚病毒載量測定
3 討論 結(jié)論 參考文獻 附錄一 附錄二 致謝 主要試劑配制


【參考文獻】：
期刊論文
[1]鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表達與免疫學(xué)檢測方法[J]. 周勇,范玉頂,徐進,馬杰,江南,劉文枝,曾令兵.  淡水漁業(yè). 2017(01)
[2]鯉皰疹病毒Ⅱ型對異育銀鯽背鰭細胞的顯微形態(tài)與免疫基因表達水平的影響[J]. 夏思瑤,王浩,Patorida Podok,許丹,姜有聲,呂利群,佐野元彥.  水產(chǎn)學(xué)報. 2016(12)
[3]鯉皰疹病毒2型ORF5截短基因的克隆表達及免疫原性研究[J]. 廖紅,林華,郝中香,佘容,陳世界,楊苗,陳珍容,薛昌華,趙珊,韓國全,曹三杰,顏其貴.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2016(11)
[4]鯽造血器官壞死癥的防控策略[J]. 曾令兵,張治平,馬杰,劉文枝.  科學(xué)養(yǎng)魚. 2016(09)
[5]鯉皰疹Ⅱ型病毒（CyHV-2）感染對異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）組織器官的損傷作用[J]. 林秀秀,葉元土,吳萍,騰峰,王敏,蔣蓉,段榮會,許凡,陳卓,高李松,劉進,蔡春芳.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(03)
[6]鯉皰疹病毒Ⅱ型的理化及生物學(xué)特性和超微形態(tài)發(fā)生[J]. 馬杰,周勇,范玉頂,劉文枝,江南,曾令兵.  水產(chǎn)學(xué)報. 2016(03)
[7]急性病毒性鯽鰓出血病的病理變化[J]. 方進,鄧院生,王俊,李濤,陳中元,周莉,張奇亞.  中國水產(chǎn)科學(xué). 2016(02)
[8]一種基于Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72的免疫學(xué)檢測方法[J]. 孔善云,姜有聲,許丹,謝駿,呂利群.  中國水產(chǎn)科學(xué). 2016(02)
[9]鯉皰疹病毒2型微滴式數(shù)字PCR快速檢測方法的建立[J]. 郝中香,林華,佘容,廖紅,陳世界,楊苗,薛昌華,趙珊,韓國全,顏其貴.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2016(02)
[10]聚六亞甲基胍對異育銀鯽的急性毒性試驗[J]. 俞軍,孫琪,胡鯤,楊先樂.  漁業(yè)致富指南. 2015(09)



本文編號：3702874