Prmt5作為第二類精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,在基因表達(dá)調(diào)控、RNA加工、細(xì)胞生長(zhǎng)分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。本研究以青鳉為實(shí)驗(yàn)材料,通過酵母雙雜交cDNA文庫(kù)掃描技術(shù)篩選Prmt5的互作蛋白,并對(duì)相互作用功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了初步探討。首先以青鳉組織cDNA為模板擴(kuò)增prmt5全長(zhǎng)1905 bp,構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-prmt5。將其轉(zhuǎn)入酵母AH109和Y187細(xì)胞后,檢測(cè)到誘餌蛋白對(duì)報(bào)告基因無自激活能力,對(duì)宿主細(xì)胞也無毒性。其次,采用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建青鳉魚苗的酵母雙雜交cDNA文庫(kù),并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增和大規(guī)模轉(zhuǎn)化。文庫(kù)質(zhì)量鑒定結(jié)果顯示,合成的cDNA呈彌散狀,大小分布于100～3000 bp范圍內(nèi)。初級(jí)cDNA文庫(kù)庫(kù)容量約為1.4×106 cfu,插入片段大小在0.5～3.0kb之間,平均插入片段約為1 kb,重組率為100%。結(jié)果說明文庫(kù)cDNA片段多樣性良好,長(zhǎng)度適合雙雜交篩選。再次,將含pGBKT7-prmt5的Y187細(xì)胞和含cDNA文庫(kù)的AH109細(xì)胞進(jìn)行雜交,通過SD/-His-Leu-Trp-Ade四缺營(yíng)養(yǎng)平板和X-α-gal顯色篩選陽性菌。將初步篩選的69個(gè)克隆經(jīng)過... 

【文章頁(yè)數(shù)】：80 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 甲基化
        1.1.1 甲基化概述
        1.1.2 精氨酸甲基化酶家族研究進(jìn)展
    1.2 Prmt5的研究進(jìn)展
    1.3 酵母雙雜交技術(shù)
        1.3.1 酵母雙雜交技術(shù)概述
        1.3.2 MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3的作用機(jī)制
    1.4 青鳉——魚類模式生物
    1.5 本研究的目的及意義
2. 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 引物序列
    2.2 主要儀器設(shè)備
    2.3 主要試劑及試劑盒
        2.3.1 主要試劑及試劑盒
        2.3.2 主要溶液配制
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 實(shí)驗(yàn)材料的獲取
        2.4.2 目的基因的擴(kuò)增
        2.4.3 重組質(zhì)粒的制備
        2.4.4 誘餌載體的自激活及毒性檢測(cè)
        2.4.5 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的建立
        2.4.6 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增及質(zhì)量鑒定
        2.4.7 cDNA文庫(kù)質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株
        2.4.8 文庫(kù)宿主菌和誘餌菌株雜交
        2.4.9 陽性克隆的篩選及鑒定
        2.4.10 回交實(shí)驗(yàn)
3. 結(jié)果與分析
    3.1 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-prmt5的自激活及毒性檢測(cè)
        3.1.1 目的基因prmt5的克隆及誘餌載體的構(gòu)建
        3.1.2 確認(rèn)酵母菌株Y187和AH109的表型
        3.1.3 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-prmt5的自激活檢測(cè)
        3.1.4 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-prmt5的毒性檢測(cè)
    3.2 青鳉魚苗酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、擴(kuò)增及質(zhì)量鑒定
        3.2.1 青鳉魚苗酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
        3.2.2 cDNA文庫(kù)的質(zhì)量鑒定
    3.3 酵母雙雜交文庫(kù)篩選結(jié)果
        3.3.1 陽性克隆的篩選及鑒定
        3.3.2 同源比對(duì)結(jié)果
    3.4 青鳉Prmt5、Mep50及Prdm1a/Prdm1b的互作
        3.4.1 青鳉Prmt5、Prdm1a/Prdm1b及Mep50互作關(guān)系的驗(yàn)證
        3.4.2 青鳉Prdm1a-Mep50和Prdm1b-Mep50相互作用位點(diǎn)探究
4. 討論
    4.1 青鳉魚苗酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建及篩庫(kù)結(jié)果分析
    4.2 青鳉Prmt5、Mep50及Prdm1a/Prdm1b互作關(guān)系分析
    4.3 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA甲基化與癌癥[J]. 韓競(jìng)男,魯昊騁,梁靜.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2012(02)



本文編號(hào)：3666408