食物匱乏是動物在自然環(huán)境中生存面臨最大的威脅。脊椎動物為了維持生命以及保障繁殖而進化出脂肪組織,從而將能量以甘油三酯的形式儲存于脂滴中。當(dāng)機體受到營養(yǎng)限制脅迫時,脂肪細胞內(nèi)甘油三酯被脂肪酶分解為甘油和游離脂肪酸。其中,釋放的游離脂肪酸伴隨血液循環(huán)進入其他組織,通過氧化分解以提供能量來維持生理活動。與哺乳動物相比,魚類耐饑餓的時間更長。目前,關(guān)于營養(yǎng)限制狀況下,調(diào)控魚類脂肪細胞啟動脂解的分子機制研究還未見報道,而此類研究的缺失,直接限制了養(yǎng)殖魚類脂質(zhì)蓄積人工調(diào)控技術(shù)的發(fā)展。基于此,本論文提出以下兩個科學(xué)問題:1.魚類脂肪細胞如何響應(yīng)營養(yǎng)限制而啟動脂解過程?2.魚類脂肪細胞如何在營養(yǎng)限制狀況下避免脂解產(chǎn)生的游離脂肪酸毒性作用而維持自身穩(wěn)態(tài)?圍繞這兩個科學(xué)問題,本研究以草魚為研究對象,運用分子克隆、蛋白純化、實時熒光定量PCR、免疫熒光、蛋白印跡、脂肪細胞原代培養(yǎng)等技術(shù),對營養(yǎng)限制狀況下魚類脂肪細胞脂解過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)開展了系統(tǒng)研究,以期為魚類脂質(zhì)代謝理論的建立提供一定的基礎(chǔ)資料。本文得出以下研究結(jié)果和結(jié)論:1.ATGL是連接草魚脂肪細胞脂解與環(huán)境營養(yǎng)變化的關(guān)鍵點克隆草魚中性脂酶ATGL、HS... 

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1.脂解及脂解酶的類型
    1.2.胞內(nèi)脂解途徑相關(guān)脂酶及其調(diào)控機制
        1.2.1 中性脂肪酶介導(dǎo)的脂解
        1.2.2 自噬和酸性脂肪酶介導(dǎo)的脂解
        1.2.3 其他脂酶
    1.3 脂解代謝產(chǎn)物的分子信號作用
        1.3.1 脂解產(chǎn)生的脂肪酸與PPAR信號
        1.3.2 脂解產(chǎn)生的脂肪酸與胰島素信號
        1.3.3 脂解產(chǎn)生的DG與PKC信號
    1.4 胞內(nèi)脂酶在魚類中的研究
    1.5 本研究的目標、意義和內(nèi)容
第二章 草魚中性脂酶的克隆及其在脂肪細胞營養(yǎng)限制過程中的表達
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試驗儀器和試劑
        2.1.2 草魚前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)及處理：
        2.1.3 中性脂酶基因完整CDS的獲得
            2.1.3.1 第一鏈c DNA的合成
            2.1.3.2 引物設(shè)計
            2.1.3.3 PCR擴增
            2.1.3.4 PCR產(chǎn)物純化回收
            2.1.3.5 DNA純化產(chǎn)物連接T載體
            2.1.3.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞以及挑選陽性克隆測序
        2.1.4 脂酶序列的生物信息學(xué)分析
        2.1.5 甘油三酯含量檢測
        2.1.6 脂肪細胞脂滴及細胞核染色
        2.1.7 Real-time PCR
        2.1.8 Western Blot
        2.1.9 統(tǒng)計分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 中性脂酶CDS序列分析
        2.2.2 基因結(jié)構(gòu)分析
        2.2.3 共線性分析
        2.2.4 中性脂酶在草魚中的組織表達
        2.2.5 營養(yǎng)限制促進ATGL的表達
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 草魚脂肪細胞ATGL的功能研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 原核表達載體的構(gòu)建
        3.1.4 GB1-6*His-PET-21a(+)-ATGL重組蛋白的誘導(dǎo)表達
        3.1.5 pET-21a-PEDF重組蛋白的親和純化
        3.1.6 草魚前體脂肪細胞的培養(yǎng)
        3.1.7 甘油三酯含量測定
        3.1.8 游離脂肪酸含量的測定
        3.1.9 甘油含量的測定
        3.1.10 Gyk酶活檢測
        3.1.11 實時定量PCR(RT-PCR)
        3.1.12 脂肪細胞免疫熒光
        3.1.13 脂肪細胞脂滴及細胞核染色
        3.1.14 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 ATGL重組蛋白的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化
        3.2.2 目的蛋白的親和純化
        3.2.3 脂肪細胞對融合蛋白的吸收
        3.2.4 ATGL在草魚脂肪細胞中的定位
        3.2.5 草魚ATGL促進脂肪細胞甘油三酯的分解
        3.2.6 草魚ATGL促進脂肪細胞脂肪酸β-氧化基因及重新酯化基因的表達
        3.2.7 ATGL-PPARγ防止脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及甘油三酯的過度丟失
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 營養(yǎng)限制條件下ATGL轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要儀器
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 Genome walking
        4.1.4 草魚ATGL基因5’側(cè)翼區(qū)系列缺失體的構(gòu)建
        4.1.5 生物信息學(xué)分析
        4.1.6 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的缺失突變
        4.1.7 轉(zhuǎn)錄因子PPARα、CREB及 RXRα過表達載體的構(gòu)建
        4.1.8 細胞轉(zhuǎn)染
        4.1.9 螢光素酶活性檢測
        4.1.10 草魚原代脂肪細胞培養(yǎng)
        4.1.11 甘油三酯含量測定
        4.1.12 脂肪細胞脂滴及細胞核染色
        4.1.13 實時定量PCR(RT-PCR)
        4.1.14 Western Blot
        4.1.15 cAMP含量測定
        4.1.16 PKA酶活測定
        4.1.17 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 草魚ATGL基因5’側(cè)翼區(qū)系列報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 草魚ATGL基因核心啟動子的鑒定
        4.2.3 草魚ATGL基因核心啟動子序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測
        4.2.4 PPARα和CREB位點是維持草魚ATGL基因啟動子活性的順式作用元件
        4.2.5 cAMP/PKA/CREB調(diào)控刺激狀態(tài)下ATGL的轉(zhuǎn)錄
        4.2.6 PPARα調(diào)控基礎(chǔ)狀態(tài)下ATGL的轉(zhuǎn)錄
        4.2.7 營養(yǎng)限制條件下cAMP/PKA/CREB參與ATGL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 營養(yǎng)限制條件下CAMP/PKA-ATGL信號通路維持草魚脂肪細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的機制研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 草魚原代脂肪細胞培養(yǎng)及饑餓處理
        5.1.4 草魚的飼養(yǎng)及在體饑餓
        5.1.5 組織學(xué)觀察
        5.1.6 cAMP含量測定
        5.1.7 PKA酶活測定
        5.1.8 甘油三酯含量測定
        5.1.9 游離脂肪酸含量的測定
        5.1.10 甘油含量的測定
        5.1.11 脂肪細胞脂滴及細胞核染色
        5.1.12 實時定量PCR(RT-PCR)
        5.1.13 數(shù)據(jù)分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 PPARγ抑制饑餓過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生及防止長期饑餓時TG的過度丟失
        5.2.2 長期在體營養(yǎng)限制激活A(yù)TGL介導(dǎo)的脂解和PPARγ介導(dǎo)的脂肪酸重新酯化
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 本研究主要結(jié)論、創(chuàng)新點與下一步研究內(nèi)容
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 下一步研究內(nèi)容
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]草魚ATGL基因的表達及飼喂n-3 HUFAs對其的影響[J]. 吉紅,黃吉芹,劉品.  水產(chǎn)學(xué)報. 2012(05)



本文編號：3663197