食物匱乏是動(dòng)物在自然環(huán)境中生存面臨最大的威脅。脊椎動(dòng)物為了維持生命以及保障繁殖而進(jìn)化出脂肪組織,從而將能量以甘油三酯的形式儲(chǔ)存于脂滴中。當(dāng)機(jī)體受到營(yíng)養(yǎng)限制脅迫時(shí),脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯被脂肪酶分解為甘油和游離脂肪酸。其中,釋放的游離脂肪酸伴隨血液循環(huán)進(jìn)入其他組織,通過氧化分解以提供能量來(lái)維持生理活動(dòng)。與哺乳動(dòng)物相比,魚類耐饑餓的時(shí)間更長(zhǎng)。目前,關(guān)于營(yíng)養(yǎng)限制狀況下,調(diào)控魚類脂肪細(xì)胞啟動(dòng)脂解的分子機(jī)制研究還未見報(bào)道,而此類研究的缺失,直接限制了養(yǎng)殖魚類脂質(zhì)蓄積人工調(diào)控技術(shù)的發(fā)展�；诖�,本論文提出以下兩個(gè)科學(xué)問題:1.魚類脂肪細(xì)胞如何響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)限制而啟動(dòng)脂解過程?2.魚類脂肪細(xì)胞如何在營(yíng)養(yǎng)限制狀況下避免脂解產(chǎn)生的游離脂肪酸毒性作用而維持自身穩(wěn)態(tài)?圍繞這兩個(gè)科學(xué)問題,本研究以草魚為研究對(duì)象,運(yùn)用分子克隆、蛋白純化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光、蛋白印跡、脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)等技術(shù),對(duì)營(yíng)養(yǎng)限制狀況下魚類脂肪細(xì)胞脂解過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)開展了系統(tǒng)研究,以期為魚類脂質(zhì)代謝理論的建立提供一定的基礎(chǔ)資料。本文得出以下研究結(jié)果和結(jié)論:1.ATGL是連接草魚脂肪細(xì)胞脂解與環(huán)境營(yíng)養(yǎng)變化的關(guān)鍵點(diǎn)克隆草魚中性脂酶ATGL、HS... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號(hào)對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1.脂解及脂解酶的類型
    1.2.胞內(nèi)脂解途徑相關(guān)脂酶及其調(diào)控機(jī)制
        1.2.1 中性脂肪酶介導(dǎo)的脂解
        1.2.2 自噬和酸性脂肪酶介導(dǎo)的脂解
        1.2.3 其他脂酶
    1.3 脂解代謝產(chǎn)物的分子信號(hào)作用
        1.3.1 脂解產(chǎn)生的脂肪酸與PPAR信號(hào)
        1.3.2 脂解產(chǎn)生的脂肪酸與胰島素信號(hào)
        1.3.3 脂解產(chǎn)生的DG與PKC信號(hào)
    1.4 胞內(nèi)脂酶在魚類中的研究
    1.5 本研究的目標(biāo)、意義和內(nèi)容
第二章 草魚中性脂酶的克隆及其在脂肪細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)限制過程中的表達(dá)
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試驗(yàn)儀器和試劑
        2.1.2 草魚前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及處理：
        2.1.3 中性脂酶基因完整CDS的獲得
            2.1.3.1 第一鏈c DNA的合成
            2.1.3.2 引物設(shè)計(jì)
            2.1.3.3 PCR擴(kuò)增
            2.1.3.4 PCR產(chǎn)物純化回收
            2.1.3.5 DNA純化產(chǎn)物連接T載體
            2.1.3.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞以及挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序
        2.1.4 脂酶序列的生物信息學(xué)分析
        2.1.5 甘油三酯含量檢測(cè)
        2.1.6 脂肪細(xì)胞脂滴及細(xì)胞核染色
        2.1.7 Real-time PCR
        2.1.8 Western Blot
        2.1.9 統(tǒng)計(jì)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 中性脂酶CDS序列分析
        2.2.2 基因結(jié)構(gòu)分析
        2.2.3 共線性分析
        2.2.4 中性脂酶在草魚中的組織表達(dá)
        2.2.5 營(yíng)養(yǎng)限制促進(jìn)ATGL的表達(dá)
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 草魚脂肪細(xì)胞ATGL的功能研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.4 GB1-6*His-PET-21a(+)-ATGL重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.5 pET-21a-PEDF重組蛋白的親和純化
        3.1.6 草魚前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.1.7 甘油三酯含量測(cè)定
        3.1.8 游離脂肪酸含量的測(cè)定
        3.1.9 甘油含量的測(cè)定
        3.1.10 Gyk酶活檢測(cè)
        3.1.11 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)
        3.1.12 脂肪細(xì)胞免疫熒光
        3.1.13 脂肪細(xì)胞脂滴及細(xì)胞核染色
        3.1.14 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 ATGL重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
        3.2.2 目的蛋白的親和純化
        3.2.3 脂肪細(xì)胞對(duì)融合蛋白的吸收
        3.2.4 ATGL在草魚脂肪細(xì)胞中的定位
        3.2.5 草魚ATGL促進(jìn)脂肪細(xì)胞甘油三酯的分解
        3.2.6 草魚ATGL促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪酸β-氧化基因及重新酯化基因的表達(dá)
        3.2.7 ATGL-PPARγ防止脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及甘油三酯的過度丟失
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 營(yíng)養(yǎng)限制條件下ATGL轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要儀器
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 Genome walking
        4.1.4 草魚ATGL基因5’側(cè)翼區(qū)系列缺失體的構(gòu)建
        4.1.5 生物信息學(xué)分析
        4.1.6 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失突變
        4.1.7 轉(zhuǎn)錄因子PPARα、CREB及 RXRα過表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        4.1.9 螢光素酶活性檢測(cè)
        4.1.10 草魚原代脂肪細(xì)胞培養(yǎng)
        4.1.11 甘油三酯含量測(cè)定
        4.1.12 脂肪細(xì)胞脂滴及細(xì)胞核染色
        4.1.13 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)
        4.1.14 Western Blot
        4.1.15 cAMP含量測(cè)定
        4.1.16 PKA酶活測(cè)定
        4.1.17 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 草魚ATGL基因5’側(cè)翼區(qū)系列報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 草魚ATGL基因核心啟動(dòng)子的鑒定
        4.2.3 草魚ATGL基因核心啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)
        4.2.4 PPARα和CREB位點(diǎn)是維持草魚ATGL基因啟動(dòng)子活性的順式作用元件
        4.2.5 cAMP/PKA/CREB調(diào)控刺激狀態(tài)下ATGL的轉(zhuǎn)錄
        4.2.6 PPARα調(diào)控基礎(chǔ)狀態(tài)下ATGL的轉(zhuǎn)錄
        4.2.7 營(yíng)養(yǎng)限制條件下cAMP/PKA/CREB參與ATGL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 營(yíng)養(yǎng)限制條件下CAMP/PKA-ATGL信號(hào)通路維持草魚脂肪細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 草魚原代脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及饑餓處理
        5.1.4 草魚的飼養(yǎng)及在體饑餓
        5.1.5 組織學(xué)觀察
        5.1.6 cAMP含量測(cè)定
        5.1.7 PKA酶活測(cè)定
        5.1.8 甘油三酯含量測(cè)定
        5.1.9 游離脂肪酸含量的測(cè)定
        5.1.10 甘油含量的測(cè)定
        5.1.11 脂肪細(xì)胞脂滴及細(xì)胞核染色
        5.1.12 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)
        5.1.13 數(shù)據(jù)分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 PPARγ抑制饑餓過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生及防止長(zhǎng)期饑餓時(shí)TG的過度丟失
        5.2.2 長(zhǎng)期在體營(yíng)養(yǎng)限制激活A(yù)TGL介導(dǎo)的脂解和PPARγ介導(dǎo)的脂肪酸重新酯化
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 本研究主要結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與下一步研究?jī)?nèi)容
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 下一步研究?jī)?nèi)容
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]草魚ATGL基因的表達(dá)及飼喂n-3 HUFAs對(duì)其的影響[J]. 吉紅,黃吉芹,劉品.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2012(05)



本文編號(hào)：3663197