弧菌病是水產養(yǎng)殖業(yè)最重要的細菌病之一,其爆發(fā)后死亡率高,給我國水產養(yǎng)殖業(yè)造成重大經濟損失。人們?yōu)榱朔乐嗡a動物弧菌病,大量盲目使用抗生素,使耐藥性菌株不斷出現(xiàn),使病害更加難以控制,需要不斷地尋找新的、安全的抗菌藥物。海洋真菌因其獨特生長代謝機制,具有產生大量結構新穎、活性強的化合物的潛力,成為當下國內外學者研究的熱點。本研究以篩選抗弧菌的活性化合物為目標,建立刃天青熒光高通量微量顯色法,優(yōu)化刃天青顯色法實驗條件,并對比平板稀釋法,評價了刃天青方法在測定藥物對弧菌最低抑菌濃度（MIC）實驗中的適用可行性,并實現(xiàn)了對來源于32株海洋真菌的916個初級餾分的活性篩選,具有直觀、可靠、靈敏、微量、經濟等優(yōu)點。根據(jù)篩選結果和相關文獻報道挑出尖刀鐮孢菌、白色側齒霉、黃曲霉三株真菌進行重新發(fā)酵,利用正相反相柱層析、TLC、HPLC方法分離出次級餾分,用刃天青顯色方法進行活性跟蹤,從白色側齒霉發(fā)酵物中分離出對供試弧菌均有抑菌活性的新化合物EngyodontiuminA。萜類化合物及其衍生物是自然界分布最廣泛、結構最復雜的一類次生化合物。生物體內的萜類化合物主要有兩種生物合成途徑：甲羥戊酸途徑（meva... 

【文章來源】：廈門大學福建省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語一覽表
第一部分 前言
    1 弧菌病危害及流行特征
        1.1 弧菌病及感染傳播途徑
        1.2 弧菌形態(tài)、分類
        1.3 弧菌的致病機理
        1.4 弧菌病的治療
    2. 高通量藥物篩選技術概述
        2.1 細胞水平藥物篩選模型
        2.2 分子水平篩選模型
            2.2.1 萜類及生物合成途徑概述
    3 海洋真菌
    4. 本論文立題依據(jù)及研究意義
第二部分 材料與方法
    1 實驗材料
        1.1 培養(yǎng)基
        1.2 相關溶液的配制
        1.3 工具酶
        1.4 試劑盒
        1.5 相關試劑與藥品
        1.6 主要儀器與設備
        1.7 供試海洋真菌及病原菌、質粒及菌種
    2 刃天青高通量篩選抗弧菌活性化合物方法的建立
        2.1 弧菌的培養(yǎng)
        2.2 刃天青篩選方法最適條件的確定
        2.3 環(huán)丙沙星及紅霉素抗弧菌的最低抑菌濃度的測定
            2.3.1 刃天青法
            2.3.2 平板稀釋法
        2.4 刃天青作為顯示劑高通量檢測海洋真菌天然餾分抗弧菌活性
            2.4.1 海洋真菌初級餾分庫的建立
            2.4.2 高通量篩選抗弧菌的活性餾分
            2.4.3 高通量篩選技術參數(shù)評價
            2.4.4 海洋真菌天然次級餾分的制備
            2.4.5 次級餾分的篩選及單一化合物MIC及MBC的測定
    3 以Dxr為靶點的新型抗弧菌藥物分子水平模型的建立和應用
        3.1 DNA相關實驗和方法
            3.1.1 創(chuàng)傷弧菌E1758總基因組的提取E1758
            3.1.2 大腸桿菌感受態(tài)的制備
            3.1.3 轉化
            3.1.4 小量質粒DNA的提取
            3.1.5 脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶基因克隆及測序
        3.2 His-DXR融合蛋白誘導表達及純化
            3.2.1 His-DXR融合蛋白的原核表達
            3.2.2 采用Ni-NTA親和層析純化重組蛋白
            3.2.3 SDS-PAGE
            3.2.4 測定蛋白濃度
            3.2.5 Ni-NTA再生和制備
        3.3 抑制His-DXR酶活性次級餾分的篩選
            3.3.1 還原型輔酶ⅡOD值-濃度線性標準曲線的制作
            3.3.2 1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶(His-DXR)的活性測定
            3.3.3 篩選模型的初步建立
第三部分 實驗結果與分析
    1 刃天青高通量篩選抗弧菌活性化合物方法的建立
        1.1 刃天青高通量篩選最適條件的確定
        1.2 環(huán)丙沙星及紅霉素抗弧菌的最低抑菌濃度的測定
        1.3 刃天青作為顯示劑高通量檢測海洋真菌天然餾分抗弧菌活性
        1.4 次級餾分的篩選及單一化合物MIC及MBC的測定
    2 以Dxr為靶點的新型抗弧菌藥物分子水平模型的建立
        2.1 pET-22b~+-dxr表達載體的構建和鑒定
        2.2 His-DXR融合蛋白的誘導表達及純化
        2.3 His-DXR蛋白濃度的測定
        2.4 還原型輔酶ⅡOD值-濃度線性標準曲線的制作
        2.5 重組His-DXR的酶活性的測定及NADPH穩(wěn)定性考察
        2.6 最適酶活反應條件的測定
            2.6.1 緩沖溶液濃度的確定
            2.6.2 體系反應溫度的確定
            2.6.3 反應體系pH的確定
            2.6.4 Mg~(2+)加入濃度的確定
            2.6.5 反應體系中DXP加入量的確定
            2.6.6 標準品膦胺霉素及海洋真菌次級餾分酶活抑制實驗
第四部分 討論
    1 刃天青高通量篩選抗弧菌活性化合物方法的建立
    2 以Dxr為靶點的新型抗弧菌藥物分子水平模型的建立
    3 本論文的創(chuàng)新之處
第五部分 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3632149