黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）是中國的一種重要的養(yǎng)殖魚類,但它體型較小、生長較慢,限制了黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。為獲得大規(guī)格且快速生長的黃顙魚,本論文開展了黃顙魚轉(zhuǎn)基因和基因敲除的研究。首先,比較了精子載體法和顯微注射法將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件導(dǎo)入黃顙魚受精卵的效率。其次,應(yīng)用顯微注射法將以黃顙魚β-actin基因啟動子驅(qū)動黃色熒光蛋白報告基因構(gòu)件導(dǎo)入黃顙魚受精卵,獲得了轉(zhuǎn)黃色熒光蛋白基因黃顙魚1尾,證明黃顙魚β-actin基因啟動子可驅(qū)動報告基因表達(dá)。第三,通過將黃顙魚β-actin基因啟動子驅(qū)動的“全魚”轉(zhuǎn)生長激素基因構(gòu)件導(dǎo)入黃顙魚受精卵,獲得轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因黃顙魚1尾。最后,為制作不育系黃顙魚,運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得gnrh1與gnrh2基因單或雙敲除的雜合子黃顙魚51尾。以上結(jié)果成功地建立了黃顙魚基因組改造的技術(shù)平臺,為黃顙魚的基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。1.比較了精子載體法和顯微注射法將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件導(dǎo)入黃顙魚受精卵的效率。將含黃顙魚1017 bp β-actin基因5’-起始密碼子上游側(cè)翼序列的近端啟動子驅(qū)動的黃色熒光蛋白報告... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２．１?１７５６?ｂｐ黃顙魚ｐ－ａｃｔｉｎ基因片段示意圖

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精卵數(shù)量約３０００枚。其中的一次共獲得發(fā)育至受精后２４小時以上的胚胎６７０??枚，對受精后２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的胚胎在熒光顯微鏡下進(jìn)行了觀察，可觀測到表??達(dá)熒光蛋白的胚胎共４５１枚，具全身廣泛性表達(dá)的有７７枚，結(jié)果見圖２．３。結(jié)果??表明顯微注射法可以有效將Ｔｇ?轉(zhuǎn)入黃顙魚胚胎并有效表達(dá)。??以上結(jié)果顯示，精子載體法雖然具有操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，但是其轉(zhuǎn)移效率太低，??在約８０００枚受精卵中均未見到黃色焚光蛋白的表達(dá)；而顯微注射法獲得表達(dá)熒??光蛋白的黃顙魚胚胎共４５１枚，具全身廣泛性表達(dá)黃顙魚胚胎７７枚。由此可見，??顯微注射技術(shù)可作為有效的轉(zhuǎn)基因方法應(yīng)用于黃顙魚轉(zhuǎn)基因制作。??２４??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 鄭小梅,張曉立,于建東,鄭平,孫際賓.  生物技術(shù)進(jìn)展. 2015(01)
[2]轉(zhuǎn)基因魚的安全性及檢測技術(shù)[J]. 李風(fēng)鈴,江艷華,姚琳,王聯(lián)珠,翟毓秀.  食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報. 2014(01)
[3]轉(zhuǎn)基因魚類生態(tài)安全的研究進(jìn)展[J]. 吳晗,姜鵬,白俊杰.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2013(11)
[4]轉(zhuǎn)基因魚的研究進(jìn)展與商業(yè)化前景[J]. 葉星,田園園,高風(fēng)英.  遺傳. 2011(05)
[5]Integration mechanisms of transgenes and population fitness of GH transgenic fish[J]. HU Wei & ZHU ZuoYan* State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China.  Science China（Life Sciences）. 2010(04)
[6]快速生長導(dǎo)致轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因鯉魚臨界游泳速度的降低[J]. 李德亮,傅萃長,胡煒,鐘山,汪亞平,朱作言.  科學(xué)通報. 2007(08)
[7]轉(zhuǎn)生長激素基因中華倒刺鲃的構(gòu)建及其檢測[J]. 丁潔,顧繼銳,伍翠芳,李永文,張濤,吳江,謝顯連,徐恒.  淡水漁業(yè). 2006(03)
[8]黃顙魚生長激素cDNA序列克隆及其序列分析[J]. 孫玉華,謝從新.  水利漁業(yè). 2006(03)
[9]電脈沖作用將外源基因?qū)胂∮絮L鯽精子的研究[J]. 鐘家玉,茅衛(wèi)鋒,朱作言.  遺傳學(xué)報. 2002(02)
[10]用精子載體法將MT-hGH基因?qū)胩┥匠圜[魚[J]. 翟玉梅,鹿培源,崔博文,王喆,時永香,楊曉梅,趙晶,岳永生.  海洋與湖沼. 2001(01)



本文編號：3497958