親蝦繁育技術(shù)在對蝦養(yǎng)殖過程中一直是一個(gè)非常重要的限制因素，而通常采用的眼柄切除技術(shù)或者捕撈野生親蝦的方法在實(shí)際生產(chǎn)活動(dòng)中存在傷害親蝦或者資金投入過大等問題[1,2]。因此探尋新的親蝦繁育技術(shù)勢在必行。本實(shí)驗(yàn)擬在分子層面，以斑節(jié)對蝦為模式生物對卵巢發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白H，細(xì)胞周期蛋白E等基因進(jìn)行研究，進(jìn)而為斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室通過高通量測序建立的EST文庫的基礎(chǔ)上,篩選出了幾個(gè)與卵巢發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白EST序列,利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆出全長cDNA序列，并利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)對這些發(fā)育相關(guān)基因在組織分中布，卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，以及經(jīng)過蛻皮抑制激素（MIH）注射后相應(yīng)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。此外還選取了具有代表性的細(xì)胞周期蛋白B進(jìn)行了重組表達(dá)及免疫組化研究。結(jié)果如下：1)采用RACE技術(shù)克隆得到一條全長1706bp的細(xì)胞周期蛋白E基因cDNA序列，并命名為PmcycE。該序列包含132bp的5非編碼區(qū)（UTR）和311bp的3非編碼區(qū)以及1263bp的開放閱讀框（ORF），可編碼420個(gè)氨基酸。預(yù)測的分子量約為47.91kDa，理... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期示意圖

不同的周期蛋白與不同的 CDK激酶的結(jié)合展現(xiàn)出不同的 CDK激酶活性（圖1-2）。哺乳動(dòng)物細(xì)胞分裂過程中，周期蛋白 A 于 G1 期的早期開始表達(dá)并積累，在 G1 期/S 期的交界處逐漸達(dá)到峰值，此峰值將持續(xù)至 G2 期/M 期[35, 36]。周期蛋白 B 則從 G1 期的晚期開始表達(dá)積累，于 G2 期的末期達(dá)到峰值并持續(xù)至 M 期才開始降解[29]。周期蛋白 D、H 在細(xì)胞周期中呈現(xiàn)持續(xù)表達(dá)趨勢[37, 38]，周期蛋白 E則與 M 期晚期及 G1 期早期開始表達(dá)并一直持續(xù)到 G2 期的末期。細(xì)胞周期蛋白在酵母中的表達(dá)情況與哺乳動(dòng)物中的類似[23]。

圖 2-1 3’端 RACE 擴(kuò)增原理示意圖（詳見 TaKaRa 說明書）Fig2-1 sketch map of the 3’RACE (From the specification of TaKaRa)2.3.5.2.1 PCR 擴(kuò)增在 3’RACE 中，利用 Semi-nested (半巢式) PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[86]，首先分別由 cycH-F1、cycE-F1 與 AP（接頭引物：Adaptor primer）進(jìn)行 PCR 對擴(kuò)反應(yīng)，所得產(chǎn)物進(jìn)行 100 倍稀釋后，取 1μL作為模板，利用 cycH-F2、cycE-F2 和Adaptor primer 進(jìn)行 PCR 二次擴(kuò)增。（1）一擴(kuò) PCR 反應(yīng)體系配方：10×ExTaq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture (2.5 mM)2μL；cycH-F1(cycE-F1)（10μM）1μL；Adaptor primer（10μM）1μL；ExTaq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。一擴(kuò) PCR 實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)程序如下所示：

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]中國明對蝦免疫等相關(guān)基因的克隆、重組表達(dá)與功能分析[D]. 張繼泉.中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所） 2005

碩士論文
[1]細(xì)胞周期蛋白生物信息學(xué)分析[D]. 萬晶.西南交通大學(xué) 2012
[2]斑節(jié)對蝦幾種激素和基因與卵巢發(fā)育相關(guān)性的研究[D]. 周俊.上海海洋大學(xué) 2012



本文編號：3493809