草魚(yú)TAB1蛋白的原核重組表達(dá)及其抗體制備
發(fā)布時(shí)間：2021-11-09 01:48
為了制備草魚(yú)重組TAB1蛋白（rCiTAB1）及其特異性抗體,首先以草魚(yú)頭腎組織c DNA為模板,PCR擴(kuò)增Ci TAB1基因全長(zhǎng)序列,并依次構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒p MD19-T-Ci TAB1與重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Ci TAB1。該重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)0.5 mmol·L-1 IPTG,37℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h后獲得以包涵體形式表達(dá)的重組CiTAB1蛋白（rCiTAB1）。然后,采用3種不同方法對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行變性,發(fā)現(xiàn)與高濃度尿素直接變性法和洗滌后尿素變性法相比,洗滌后梯度尿素變性法處理后的蛋白純度最好,經(jīng)透析復(fù)性后得到濃度為2 mg·mL-1的r Ci TAB1。最后,將rCiTAB1蛋白與白油佐劑及免疫增強(qiáng)劑混合,室溫下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西蘭大白兔制備兔抗CiTAB1抗體,經(jīng)間接ELISA方法和免疫瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)得免疫后第33天血清中特異性抗體的效價(jià)分別為1∶1 048 576和1∶16。Western blot檢測(cè)到一條分子量約為72 kDa的特異性條帶,表明該抗體能特異性識(shí)別r Ci TAB1蛋白。研究結(jié)果為后續(xù)...
【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,47(02)CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)
【部分圖文】：
表達(dá)重組質(zhì)粒p ET-32a-Ci TAB1的PCR與雙酶切鑒定
重組質(zhì)粒p ET-32a-Ci TAB1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
圖2 重組質(zhì)粒p ET-32a-Ci TAB1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析對(duì)空質(zhì)粒pET-32a和鑒定正確的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-Ci TAB1進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分別在21 kDa和72 kDa附近出現(xiàn)2條濃染的蛋白條帶，分別與預(yù)期的標(biāo)簽蛋白與r Ci TAB1蛋白的分子量大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒得到表達(dá)。分別取菌液超聲破碎后的上清部分和沉淀部分進(jìn)行10%SDS-PAGE，進(jìn)一步分析表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)，結(jié)果顯示上清部分幾乎無(wú)蛋白表達(dá)，而沉淀部分有大量表達(dá)的目的蛋白，表明r Ci TAB1是以包涵體形式表達(dá)的。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]洗滌條件對(duì)重組TATm-survivin（T34A）包涵體純度的影響[J]. 張海毅. 生物化工. 2017(06)
[2]與PRRSV nsp11互作的宿主細(xì)胞蛋白鑒定及生物信息學(xué)分析[J]. 靳換,李逸,姜楠,周磊,蓋新娜,楊漢春,郭鑫. 微生物學(xué)通報(bào). 2017(12)
[3]包涵體變復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 羅莉,李坤,王保成,王明蓉. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù). 2012(04)
[4]重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 范翠英,馮利興,樊金玲,果德安,劉璇. 生物技術(shù). 2012(02)
[5]人Cε3-Cε4基因克隆、表達(dá)及純化復(fù)性[J]. 劉中成,時(shí)海浪,張艷芬,趙麗君,王培瑩,常斌,李雨詩(shī). 生物技術(shù)通報(bào). 2011(11)
[6]抗TNFα單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性表達(dá)條件的研究[J]. 楊濤,楊利軍,張建林,張悅紅,牛勃. 藥物生物技術(shù). 2010(06)
[7]包涵體的形成原因及其處理方法[J]. 鄺愛(ài)麗,陳圓圓,彭志峰,鄭鹿平,付仁一,徐雪,郭倫濤,王川慶. 上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2009(01)
博士論文
[1]變性蛋白復(fù)性裝置研制及包涵體蛋白變性和復(fù)性技術(shù)研究[D]. 馮延葉.華東理工大學(xué) 2013
碩士論文
[1]大黃魚(yú)TAK1基因與其結(jié)合蛋白TAB1和TAB2的克隆及功能研究[D]. 鮑詩(shī)源.集美大學(xué) 2018
[2]改性聚N-異丙基丙烯酰胺協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性研究[D]. 金佳鈺.浙江大學(xué) 2011
[3]GST-LRF融合蛋白純化及單克隆抗體的制備[D]. 翁偉平.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2008
本文編號(hào)：3484401
【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,47(02)CSCD
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【部分圖文】：
表達(dá)重組質(zhì)粒p ET-32a-Ci TAB1的PCR與雙酶切鑒定
重組質(zhì)粒p ET-32a-Ci TAB1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
圖2 重組質(zhì)粒p ET-32a-Ci TAB1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析對(duì)空質(zhì)粒pET-32a和鑒定正確的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-Ci TAB1進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分別在21 kDa和72 kDa附近出現(xiàn)2條濃染的蛋白條帶，分別與預(yù)期的標(biāo)簽蛋白與r Ci TAB1蛋白的分子量大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒得到表達(dá)。分別取菌液超聲破碎后的上清部分和沉淀部分進(jìn)行10%SDS-PAGE，進(jìn)一步分析表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)，結(jié)果顯示上清部分幾乎無(wú)蛋白表達(dá)，而沉淀部分有大量表達(dá)的目的蛋白，表明r Ci TAB1是以包涵體形式表達(dá)的。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]洗滌條件對(duì)重組TATm-survivin（T34A）包涵體純度的影響[J]. 張海毅. 生物化工. 2017(06)
[2]與PRRSV nsp11互作的宿主細(xì)胞蛋白鑒定及生物信息學(xué)分析[J]. 靳換,李逸,姜楠,周磊,蓋新娜,楊漢春,郭鑫. 微生物學(xué)通報(bào). 2017(12)
[3]包涵體變復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 羅莉,李坤,王保成,王明蓉. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù). 2012(04)
[4]重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 范翠英,馮利興,樊金玲,果德安,劉璇. 生物技術(shù). 2012(02)
[5]人Cε3-Cε4基因克隆、表達(dá)及純化復(fù)性[J]. 劉中成,時(shí)海浪,張艷芬,趙麗君,王培瑩,常斌,李雨詩(shī). 生物技術(shù)通報(bào). 2011(11)
[6]抗TNFα單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性表達(dá)條件的研究[J]. 楊濤,楊利軍,張建林,張悅紅,牛勃. 藥物生物技術(shù). 2010(06)
[7]包涵體的形成原因及其處理方法[J]. 鄺愛(ài)麗,陳圓圓,彭志峰,鄭鹿平,付仁一,徐雪,郭倫濤,王川慶. 上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2009(01)
博士論文
[1]變性蛋白復(fù)性裝置研制及包涵體蛋白變性和復(fù)性技術(shù)研究[D]. 馮延葉.華東理工大學(xué) 2013
碩士論文
[1]大黃魚(yú)TAK1基因與其結(jié)合蛋白TAB1和TAB2的克隆及功能研究[D]. 鮑詩(shī)源.集美大學(xué) 2018
[2]改性聚N-異丙基丙烯酰胺協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性研究[D]. 金佳鈺.浙江大學(xué) 2011
[3]GST-LRF融合蛋白純化及單克隆抗體的制備[D]. 翁偉平.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2008
本文編號(hào)：3484401
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