為探知 tyrp1b、chmp7和konk3三種功能基因在魚類中的準確作用和對魚類功能性狀的影響,本文以斑馬魚為研究對象,采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導三種基因的定點突變。設計Cas9靶位點,構建100 ng/μL的Cas9/gRNA顯微注射至斑馬魚單細胞期胚胎,采用Nest-PCR,片段測序和T7EI酶切檢測各基因的突變效應,并進一步檢測F1代突變頻率,探討。試驗結果如下：1.通過PCR片段測序和T7EI酶切兩種方法來確定tyrp1b、chmp7和kank3三個基因的單一高效靶位點,發(fā)現(xiàn)tyrp1b基因的b1靶位點,chmp7基因的t1靶位點,kank3基因的c3靶位點的基因突變非常高效,均可應用于后續(xù)繁育工作。2.將100 ng/μL的Cas9/gRNA顯微注射,合理控制Cas9/gRNA劑量很重要,過高劑量的Cas9/gRNA會導致魚群畸形或死亡。3.F0代測序、F1代測序和TA克隆結果表明,Cas9介導的基因突變可隨生殖細胞遺傳至下一代,表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因突變具有可遺傳性。4.統(tǒng)計各基因突變率,發(fā)現(xiàn)cas9介導的tyrp1b突變率達到38.5%-45.... 

【文章來源】：山西農業(yè)大學山西省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)結構??

性切割通常發(fā)生在鞭位點互補堿基旁的ＰＡＭ序列上游，其特異性由ＰＡＭ區(qū)前２０?ｂｐ的??ＲＮＡ－ＤＮＡ區(qū)（ＮＣＣ結構）相互作用決定。而Ｃａｓ９的蛋白成分在與ｏｒ民ＮＡ和比ａｃｒＲＮＡ組??成復合體口?１］時，活性核蛋白通過識別并切割對應于ｃｒＲＮＡ序列的ＤＮＡ序列，避免外源??啜菌體或質粒入侵宿主細胞。該系統(tǒng)工作過程如圖２所示。??在基因組編輯過程中，ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ的必需部分可Ｗ合并成單鏈向導ＲＮＡ??（ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，ｇＲＮＡ），連接在基因組中ＰＡＭ序列的后面，與Ｃａｓ９高效作用引起靴位點??（２０?ｂ的產生ＤＮＡ雙鏈斷裂。其介導ＤＮＡ雙鏈斷裂的過程如下：首先，ｔｒａｃｒＲＮＡ和??ｐｒｅ－ＲＮＡ?ａ打ａｙ被轉錄；其次，ｔｒａｃｒ民ＮＡ雜交至Ｉｊ?ｐｒｅ－民ＮＡ?ａｒｒａｙ重復序歹ｉｊ上并與Ｃａｓ９結??合在一起形成二聚體，進一步介導ｐｒｅ－ＲＮＡ到成熟ｃｒＲＮＡ；再次，成熟的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ??二聚體通過ｃｒ民ＮＡ上的巧ａｃｅｒｓ與ＤＮＡ靴序列上的ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ形成異源二聚體；最后，??在?ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ?中，Ｃａｓ９?在靴?ＤＮＡ?的?ＰＡＭ?上游介導產生?Ｄｏｕｂｌｅ?Ｓｔａｒａｎｄ?Ｂｒｅａｋｓ?口２—２４］。??斷裂的ＤＮＡ在細胞內通過兩種不同的修復系統(tǒng)而發(fā)生作用，即非同源末端連接??（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄｉｎｇ?ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥ＊�。┗蛲粗亟M（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＨＲ），而??這兩種修復途徑均會引入突變。??Ｇｅｎｏｍ把?ｌｏｃｕｓ?——?麵＾?１ＨＨ???Ｉ?ｔ??

已首次使用ＣＲＩＳＰ民技術完成了?ＲＮＡ介導的人類基因組編輯。杜克大學Ｐｒａｔｔ工程學院??的Ｇｅｒｓｂａ濁研究組ＰＳＩ己開始嘗試使用ＣＲＩＳＰＲ技術進行基因治療。作為新興的基因組??編輯技術，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系統(tǒng)的相關研究正呈爆發(fā)式增長，如圖３所示。??１２００????論?１０００??——??妄?國??發(fā)８孤?????Ｈ??美?圓??數(shù)?６００??－?－．．．．疏???黑柳?１?１??－?２?郵?Ｉ?１０３?■?■■—??２０１１?２０１２?２０１３?２０１４?２０１己??論文發(fā)表年化（年）??圖３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系統(tǒng)相關研究的論文數(shù)目??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?打ｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｒｄａ化ｄ?ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?Ｃ民ＩＳＰＲ／Ｃａｓ?ｓｙｓ化ｍ??基因組編輯技術在水產生物中的研究成果相當顯著，而斑馬魚Ｃ〇ａ加０?ｗＷｏ）作為模??式物種，其基因編輯的研究歷史最為悠久。２００８年Ｄｏｙｏｎ等Ｐ７�。暧茫冢疲渭夹g在斑馬魚??體細胞和性細胞中同步打靴Ｗ／基因，同年Ｍｅｎｇ等也采用ＺＦＮ技術對Ａ成基因定向??打靴。２０１１年Ｓａｎｄｅ等Ｐ９詩Ｉｊ用ＴＡＬＥＮ技術對斑馬魚巧相扣和Ａ巧２基因進行靴向實驗，??同年化ａｎｇ等口Ｇ］利用ＴＡＬＥＮ技術介導化佩基因打靴。２０１２年中，Ｍｏｏｒｅ等口｜］、Ｃａｄｅ??等［３２］、Ｄ化ｌｅｍ等［３３］逐巧Ｗ?ＴＡＬＥＮ技術檢測了特異位點的基因功能。２０１３年Ｎａｎｎａｎ??Ｃｈａｎｇ等［３４蝴用ｃａｓ９技術分別對艦巧＞、護輸４和基因進行打靴

【參考文獻】：
期刊論文
[1]動物毛色候選基因TYRP1的研究進展[J]. 李麗莎,李祥龍.  河北科技師范學院學報. 2015(04)
[2]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點編輯中的研究進展[J]. 解莉楠,宋鳳艷,張旸.  中國農業(yè)科學. 2015(09)
[3]基因組編輯:植物生物技術的機遇與挑戰(zhàn)[J]. 程曦,王文義,邱金龍.  生物技術通報. 2015(04)
[4]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)
[5]CRISPR/Cas9介導的基因組定點編輯技術[J]. 方銳,暢飛,孫照霖,李寧,孟慶勇.  生物化學與生物物理進展. 2013(08)
[6]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao.  Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[7]類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）介導的基因組定點修飾技術[J]. 沈延,肖安,黃鵬,王唯曄,朱作言,張博.  遺傳. 2013(04)
[8]鯉四種經濟性狀的微衛(wèi)星標記分析[J]. 呂偉華,趙元鳳,匡友誼,鄭先虎,溫曉曦,孫效文.  水產學雜志. 2011(04)
[9]TYRP1基因控制動物色素形成的研究進展[J]. 崔嘉,孫守榮,苗魯旭,席冬梅,何奕多,毛華明,鄧衛(wèi)東.  中國畜牧獸醫(yī). 2009(09)
[10]CRISPR及其在原核生物防御系統(tǒng)中的作用[J]. 王菲,羅恩杰.  熱帶醫(yī)學雜志. 2008(10)

碩士論文
[1]山羊TYRP1基因序列分析及SNPs研究[D]. 鄭會芹.河北農業(yè)大學 2010



本文編號：3476795