�、蛐王幇捳畈《荆–yprinid herpesvirμs 2,CyHV-2）是引起養(yǎng)殖異育銀鯽（Carassiμs aμratμs gibeLio）造血器官壞死癥的致病病原。該病毒對(duì)鯽具有很高的致死率,近年來爆發(fā)的異育銀鯽皰疹病毒性造血器官壞死病給中國(guó)異育銀鯽的養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的危害,所以為了控制CyHV-2的傳播,快速診斷異育銀鯽是否感染上CyHV-2顯然是比較重要的一部分。在臨床篩查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技術(shù)已經(jīng)建立,但是穩(wěn)定性更強(qiáng)的免疫學(xué)診斷技術(shù)國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。因?yàn)閱慰寺】贵w技術(shù)擁有可以重復(fù)、抗體獲得量大、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可用于構(gòu)建免疫性更強(qiáng)的免疫學(xué)診斷技術(shù)。本研究旨在構(gòu)建一株能夠穩(wěn)定分泌針對(duì)CyHV-2上衣殼蛋白72的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系,為建立快速準(zhǔn)確的免疫學(xué)診斷技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)材料。本研究通過純化CyHV-2病毒,并從純化的CyHV-2基因組中擴(kuò)增出ORF72基因,通過制備多克隆抗體和單克隆抗體從而建立免疫性更強(qiáng)的免疫學(xué)診斷技術(shù)。主要包括以下三個(gè)方面:（1）利用從江蘇射陽(yáng)取的組織樣品進(jìn)行檢測(cè)鑒定,經(jīng)檢測(cè)鑒定確定為CyHV-2病毒后在實(shí)驗(yàn)室利用人工... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 研究的目的和意義
    2 Ⅱ型鯉皰疹病毒
        2.1 Ⅱ型鯉皰疹病毒所造成的危害
        2.2 Ⅱ型鯉皰疹病毒檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀
            2.2.1 CyHV-2 細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)
            2.2.2 電鏡診斷技術(shù)
            2.2.3 分子診斷技術(shù)
                2.2.3.1 PCR
                2.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
                2.2.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
                2.2.3.4 原位雜交技術(shù)
            2.2.4 免疫相關(guān)研究進(jìn)展
    3 病毒純化
    4 單克隆抗體技術(shù)
    5 Ⅱ型鯉皰疹病毒免疫學(xué)診斷方法的前景展望
    6 本文的設(shè)計(jì)思路
第一章 Ⅱ型鯉皰疹病毒的純化及電鏡觀察
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料與試劑
            1.1.1 試驗(yàn)材料
            1.1.2 試驗(yàn)試劑及溶液配制
        1.2 試驗(yàn)所用儀器與設(shè)備
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 CYHV-2 病毒的擴(kuò)增
                1.3.1.1 組織總DNA的提取
                1.3.1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
                1.3.1.3 病毒回感
            1.3.2 蔗糖密度梯度超速離心法純化CyHV-2 病毒
            1.3.3 純化后病毒的電鏡觀察
    2 試驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.1 異育銀鯽感染CyHV-2 病毒
        2.2 密度梯度離心純化產(chǎn)物
        2.3 病毒純化后的電鏡觀察
    3 討論
第二章 Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72的基因克隆、原核表達(dá)和多克隆抗體的制備及初步檢測(cè)分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)試劑
        1.2 所用儀器與設(shè)備
        1.3 所使用的軟件
        1.4 試驗(yàn)方法
            1.4.1 采用PCR的方法獲得病毒ORF72的基因序列
                1.4.1.1 提�、蛐王幇捳畈《究偟腄NA
                1.4.1.2 ORF72基因擴(kuò)增
                1.4.1.3 瓊脂糖凝膠電泳
                1.4.1.4 用DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增后的DNA片段
            1.4.2 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建與原核表達(dá)
                1.4.2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建
                1.4.2.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                1.4.2.3 陽(yáng)性克隆的篩選
                1.4.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析
                1.4.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
            1.4.3 目的蛋白的純化
            1.4.4 多克隆抗體的制備
            1.4.5 血清抗體特異性分析
            1.4.6 基于ORF72的病毒誘導(dǎo)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)
    2.試驗(yàn)結(jié)果和分析
        2.1 ORF72基因擴(kuò)增
        2.2 重組蛋白rORF72的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析
        2.3 重組蛋白rORF72表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.4 目的蛋白rORF72的純化
        2.5 多克隆抗體的制備及特異性分析
        2.6 基于rORF72的病毒誘導(dǎo)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)
    3.討論
第三章 Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72單克隆抗體的制備及其在異育銀鯽出血病檢測(cè)中的應(yīng)用
    1 材料與方法
        1.1 SP2/0 小鼠骨髓瘤細(xì)胞以及試驗(yàn)用小鼠
        1.2 設(shè)備及儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)用藥品與溶液配制
        1.4 抗Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72單克隆抗體的制備
            1.4.1 細(xì)胞融合及培養(yǎng)
            1.4.2 對(duì)能夠穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆
            1.4.3 用Dot Blot法對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選
            1.4.4 對(duì)篩選的細(xì)胞株進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證
        1.5 腹水制備及純化
        1.6 3D8株抗體亞型的測(cè)定
        1.7 單克隆抗體在檢測(cè)CyHV-2 中的應(yīng)用
            1.7.1 試驗(yàn)樣品的獲得
            1.7.2 檢測(cè)方法
    2.結(jié)果與分析
        2.1 rORF72單克隆抗體的制備及篩選
        2.2.rORF72單克隆抗體 3D8株細(xì)胞的亞克隆及腹水的制備
        2.3 rORF72單克隆抗體 3D8株細(xì)胞亞型的檢測(cè)
        2.4 IFA檢測(cè)
        2.5 血涂片檢測(cè)
    3.討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄：論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[4]聚六亞甲基胍對(duì)異育銀鯽造血器官壞死癥的防治效果研究[J]. 俞軍,孫琪,王會(huì)聰,蔣新益,胡鯤,楊先樂,黃保華.  淡水漁業(yè). 2015(04)
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碩士論文
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本文編號(hào)：3467519