�、蛐王幇捳畈《荆–yprinid herpesvirμs 2,CyHV-2）是引起養(yǎng)殖異育銀鯽（Carassiμs aμratμs gibeLio）造血器官壞死癥的致病病原。該病毒對鯽具有很高的致死率,近年來爆發(fā)的異育銀鯽皰疹病毒性造血器官壞死病給中國異育銀鯽的養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的危害,所以為了控制CyHV-2的傳播,快速診斷異育銀鯽是否感染上CyHV-2顯然是比較重要的一部分。在臨床篩查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技術已經建立,但是穩(wěn)定性更強的免疫學診斷技術國內外尚無報道。因為單克隆抗體技術擁有可以重復、抗體獲得量大、特異性強等優(yōu)點,可用于構建免疫性更強的免疫學診斷技術。本研究旨在構建一株能夠穩(wěn)定分泌針對CyHV-2上衣殼蛋白72的單克隆抗體的雜交瘤細胞系,為建立快速準確的免疫學診斷技術提供實驗材料。本研究通過純化CyHV-2病毒,并從純化的CyHV-2基因組中擴增出ORF72基因,通過制備多克隆抗體和單克隆抗體從而建立免疫性更強的免疫學診斷技術。主要包括以下三個方面:（1）利用從江蘇射陽取的組織樣品進行檢測鑒定,經檢測鑒定確定為CyHV-2病毒后在實驗室利用人工... 

【文章來源】：上海海洋大學上海市

【文章頁數】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 研究的目的和意義
    2 Ⅱ型鯉皰疹病毒
        2.1 Ⅱ型鯉皰疹病毒所造成的危害
        2.2 Ⅱ型鯉皰疹病毒檢測技術的研究現狀
            2.2.1 CyHV-2 細胞培養(yǎng)分離技術
            2.2.2 電鏡診斷技術
            2.2.3 分子診斷技術
                2.2.3.1 PCR
                2.2.3.2 實時熒光定量PCR
                2.2.3.3 環(huán)介導等溫擴增
                2.2.3.4 原位雜交技術
            2.2.4 免疫相關研究進展
    3 病毒純化
    4 單克隆抗體技術
    5 Ⅱ型鯉皰疹病毒免疫學診斷方法的前景展望
    6 本文的設計思路
第一章 Ⅱ型鯉皰疹病毒的純化及電鏡觀察
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料與試劑
            1.1.1 試驗材料
            1.1.2 試驗試劑及溶液配制
        1.2 試驗所用儀器與設備
        1.3 試驗方法
            1.3.1 CYHV-2 病毒的擴增
                1.3.1.1 組織總DNA的提取
                1.3.1.2 聚合酶鏈式反應
                1.3.1.3 病毒回感
            1.3.2 蔗糖密度梯度超速離心法純化CyHV-2 病毒
            1.3.3 純化后病毒的電鏡觀察
    2 試驗結果與分析
        2.1 異育銀鯽感染CyHV-2 病毒
        2.2 密度梯度離心純化產物
        2.3 病毒純化后的電鏡觀察
    3 討論
第二章 Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72的基因克隆、原核表達和多克隆抗體的制備及初步檢測分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料和試驗試劑
        1.2 所用儀器與設備
        1.3 所使用的軟件
        1.4 試驗方法
            1.4.1 采用PCR的方法獲得病毒ORF72的基因序列
                1.4.1.1 提�、蛐王幇捳畈《究偟腄NA
                1.4.1.2 ORF72基因擴增
                1.4.1.3 瓊脂糖凝膠電泳
                1.4.1.4 用DNA回收試劑盒回收擴增后的DNA片段
            1.4.2 重組質粒載體的構建與原核表達
                1.4.2.1 重組質粒載體的構建
                1.4.2.2 連接產物的轉化
                1.4.2.3 陽性克隆的篩選
                1.4.2.4 誘導表達和可溶性分析
                1.4.2.5 誘導表達條件的優(yōu)化
            1.4.3 目的蛋白的純化
            1.4.4 多克隆抗體的制備
            1.4.5 血清抗體特異性分析
            1.4.6 基于ORF72的病毒誘導抗體的免疫學檢測
    2.試驗結果和分析
        2.1 ORF72基因擴增
        2.2 重組蛋白rORF72的誘導表達及可溶性分析
        2.3 重組蛋白rORF72表達條件的優(yōu)化
        2.4 目的蛋白rORF72的純化
        2.5 多克隆抗體的制備及特異性分析
        2.6 基于rORF72的病毒誘導抗體的免疫學檢測
    3.討論
第三章 Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72單克隆抗體的制備及其在異育銀鯽出血病檢測中的應用
    1 材料與方法
        1.1 SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞以及試驗用小鼠
        1.2 設備及儀器
        1.3 實驗用藥品與溶液配制
        1.4 抗Ⅱ型鯉皰疹病毒衣殼蛋白72單克隆抗體的制備
            1.4.1 細胞融合及培養(yǎng)
            1.4.2 對能夠穩(wěn)定分泌抗體的細胞株進行亞克隆
            1.4.3 用Dot Blot法對細胞上清液進行陽性克隆的篩選
            1.4.4 對篩選的細胞株進行Western Blot驗證
        1.5 腹水制備及純化
        1.6 3D8株抗體亞型的測定
        1.7 單克隆抗體在檢測CyHV-2 中的應用
            1.7.1 試驗樣品的獲得
            1.7.2 檢測方法
    2.結果與分析
        2.1 rORF72單克隆抗體的制備及篩選
        2.2.rORF72單克隆抗體 3D8株細胞的亞克隆及腹水的制備
        2.3 rORF72單克隆抗體 3D8株細胞亞型的檢測
        2.4 IFA檢測
        2.5 血涂片檢測
    3.討論
結論
參考文獻
附錄：論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3467519