【目的】基于TaqMan-MGB探針建立蝦肝腸胞蟲（EHP）熒光定量PCR檢測(cè)方法,為EHP的快速定量檢測(cè)及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)手段�！痉椒ā恳訣HP的SSU rDNA基因?yàn)闄z測(cè)靶基因,在其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物和TaqMan-MGB探針,將PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段克隆至pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-SSU^EHP（標(biāo)準(zhǔn)品）,以標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板優(yōu)化反應(yīng)體系,建立檢測(cè)EHP的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR;以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板構(gòu)建擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用試驗(yàn)�！窘Y(jié)果】制備的重組質(zhì)粒pMD18-T-SSU^EHP DNA穩(wěn)定性好,可滿足作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照的要求;標(biāo)準(zhǔn)品(pMD18-T-SSU^EHP)起始模板范圍為2.0×10¹～2.0×10⁹拷貝/反應(yīng)時(shí),建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,對(duì)應(yīng)的線性回歸方程為y=-3.232×lg（x）+39.51�；赥aqMan-MGB探針建立的EHP熒光定量PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)靈敏度可達(dá)... 

【文章來源】：西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2020,33(06)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

EHP-SSU rDNA基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP的PCR鑒定結(jié)果

以EHP的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,可獲得與預(yù)期目的片段大小一致的特異性條帶(圖1);重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序分析,所得的目的片段序列與GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因?qū)?yīng)部分序列的同源性為100 %,說明目的基因片段正確插入pMD18-T載體,即重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP構(gòu)建成功。取陽(yáng)性克隆菌液提取質(zhì)粒,測(cè)定濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù),重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP濃度為6.83×109拷貝/μl,OD260/OD280為1.96,滿足標(biāo)準(zhǔn)品的要求。圖3 熒光定量PCR的TaqMan-MGB探針濃度優(yōu)化結(jié)果

熒光定量PCR的TaqMan-MGB探針濃度優(yōu)化結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]蝦類寄生蟲病——蝦肝腸胞蟲研究進(jìn)展[J]. 段健誠(chéng),鄧高威,張慶起,高煥.  淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(03)
[2]TaqMan–MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)致對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌[J]. 童桂香,黎小正,吳祥慶,黃鸞玉,黃光華,韋信賢.  湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(04)
[3]3種蝦肝腸胞蟲PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用比較分析[J]. 葉鍵,許婷,施禮科,陳凡,王力,陳喆,章秋虎,郭水榮.  水產(chǎn)科學(xué). 2019(03)
[4]豬δ冠狀病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法的建立和應(yīng)用[J]. 李曉菲,陳婷,韓薇,孫愛榮,葛曉杰,梁文花,黃艷,王力,王彩宏,魏笑笑,秦立廷.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2019(04)
[5]黏菌素耐藥基因mcr-1 TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 施開創(chuàng),尹彥文,溫麗霞,屈素潔,王海清,胡杰.  南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2018(07)
[6]新型TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HCV-RNA方法學(xué)的建立[J]. 喬斌,李艷,汪明,熊格.  現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2017(05)
[7]檢出蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）的凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）群體的體長(zhǎng)和體重關(guān)系[J]. 劉雅梅,邱亮,程?hào)|遠(yuǎn),張慶利,萬(wàn)曉媛,黃倢.  漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展. 2017(04)
[8]舟山地區(qū)大棚凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢病因的調(diào)查分析[J]. 施慧,許文軍,謝建軍,王庚申.  中國(guó)水產(chǎn)科學(xué). 2017(02)
[9]基于TaqMan MGB探針的黑白輪枝菌檢測(cè)方法[J]. 郭立新,張祥林,陳先鋒,段維軍.  植物檢疫. 2017(01)
[10]蝦肝腸胞蟲TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 駱云慧,石堅(jiān),方磊,孟慶珍,張?chǎng)?錢冬.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2016(07)

碩士論文
[1]蝦肝腸胞蟲的流行病學(xué)及其致對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢機(jī)理的探索[D]. 程?hào)|遠(yuǎn).上海海洋大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3450848