【目的】基于TaqMan-MGB探針建立蝦肝腸胞蟲（EHP）熒光定量PCR檢測方法,為EHP的快速定量檢測及實時監(jiān)測提供技術手段�！痉椒ā恳訣HP的SSU rDNA基因為檢測靶基因,在其保守區(qū)設計特異性的擴增引物和TaqMan-MGB探針,將PCR擴增目標片段克隆至pMD18-T載體構建重組質粒pMD18-T-SSU^EHP（標準品）,以標準品DNA為模板優(yōu)化反應體系,建立檢測EHP的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR;以10倍梯度稀釋的標準品DNA為模板構建擴增標準曲線,并進行特異性、敏感性、重復性及臨床應用試驗�！窘Y果】制備的重組質粒pMD18-T-SSU^EHP DNA穩(wěn)定性好,可滿足作為標準品和陽性對照的要求;標準品(pMD18-T-SSU^EHP)起始模板范圍為2.0×10¹～2.0×10⁹拷貝/反應時,建立的標準曲線線性關系良好,對應的線性回歸方程為y=-3.232×lg（x）+39.51�；赥aqMan-MGB探針建立的EHP熒光定量PCR對標準品的檢測靈敏度可達... 

【文章來源】：西南農(nóng)業(yè)學報. 2020,33(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

EHP-SSU rDNA基因PCR擴增及重組質粒pMD18-T-SSUEHP的PCR鑒定結果

以EHP的DNA為模板進行熒光定量PCR擴增,可獲得與預期目的片段大小一致的特異性條帶(圖1);重組質粒pMD18-T-SSUEHP經(jīng)PCR鑒定及測序分析,所得的目的片段序列與GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因對應部分序列的同源性為100 %,說明目的基因片段正確插入pMD18-T載體,即重組質粒pMD18-T-SSUEHP構建成功。取陽性克隆菌液提取質粒,測定濃度并轉換為拷貝數(shù),重組質粒pMD18-T-SSUEHP濃度為6.83×109拷貝/μl,OD260/OD280為1.96,滿足標準品的要求。圖3 熒光定量PCR的TaqMan-MGB探針濃度優(yōu)化結果

熒光定量PCR的TaqMan-MGB探針濃度優(yōu)化結果

【參考文獻】：
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碩士論文
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本文編號：3450848