擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）是一種嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的病原菌,可引起養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)腹水病。大量研究表明擬態(tài)弧菌可產(chǎn)生黏附素、腸毒素和溶血素等多種毒力因子,但是其感染過(guò)程以及宿主主要靶組織尚不清楚。細(xì)菌標(biāo)記技術(shù)是使用標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)菌,以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的識(shí)別,從而達(dá)到對(duì)其定位及示蹤的目的。對(duì)此,本課題使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）標(biāo)記擬態(tài)弧菌,通過(guò)綠色熒光信號(hào)示蹤該菌在感染草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布,確定其黏附定植與生長(zhǎng)繁殖的靶組織,為魚(yú)類(lèi)腹水病的防控提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí),以p EGFP-N1為模式質(zhì)粒,巨噬細(xì)胞系RAW264.7為APC,對(duì)大腸桿菌菌影（Bacterial Ghosts,BG）的裝載和靶向遞送質(zhì)粒特性進(jìn)行驗(yàn)證,為擬態(tài)弧菌菌影型基因疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。本課題具體開(kāi)展了以下研究工作:1 擬態(tài)弧菌的EGFP基因標(biāo)記及其特性分析將EGFP基因克隆至原核表達(dá)載體p BAD24構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)pBAD24-EGFP,然后電轉(zhuǎn)至擬態(tài)弧菌04-14分離菌株的感受態(tài)細(xì)胞,獲... 

【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：50 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

EGFP基因的PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒pBAD24-EGFP的雙酶切鑒定M1、M2.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.PCR產(chǎn)物；2.雙酶切產(chǎn)物Fig.2-1PCRamplificationofEGFPgeneandenzymedigestionofrecombinantplasmidpBAD24-EGFP

圖 2-2 重組質(zhì)粒 pBAD24-EGFP 在擬態(tài)弧菌中表達(dá)后的 SDS-PAGE 分析蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1. pBAD24-EGFP 未誘導(dǎo)；2. pBAD24 誘導(dǎo)；3. pBAD24- EGFP 誘導(dǎo)Fig.2-2 SDS-PAGE analysis of the EGFP expressed in Vm strain 04-14M. protein molecular standard ;1. uninduced pBAD24- EGFP ; 2.induced pBAD24 ;3. pBAD24-EGFP induced with L-Arabinose菌株的熒光信號(hào)檢測(cè)后的標(biāo)記菌株和野生菌株菌液制備細(xì)菌抹片，熒光顯微鏡觀察細(xì)菌結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株在熒光視野下可發(fā)出明顯的綠色熒光，在明視野(圖 2-3，B1、B2)；而野生菌株未發(fā)出綠色熒光，僅在明視野下有相 2-3，A1、A2)。分別將誘導(dǎo)后的標(biāo)記菌株和野生菌株菌液過(guò)濾、洗滌后，置于流式如圖2-4所示，將標(biāo)記菌株和野生菌株的熒光強(qiáng)度峰值擬合，可發(fā)。說(shuō)明誘導(dǎo)后的標(biāo)記菌株的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于野生菌株陰性上鑒定試驗(yàn)結(jié)果，可以確定EGFP標(biāo)記的擬態(tài)弧菌構(gòu)建成功。

圖 2-2 重組質(zhì)粒 pBAD24-EGFP 在擬態(tài)弧菌中表達(dá)后的 SDS-PAGE 分析M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1. pBAD24-EGFP 未誘導(dǎo)；2. pBAD24 誘導(dǎo)；3. pBAD24- EGFP 誘導(dǎo)Fig.2-2 SDS-PAGE analysis of the EGFP expressed in Vm strain 04-14M. protein molecular standard ;1. uninduced pBAD24- EGFP ; 2.induced pBAD24 ;3. pBAD24-EGFP induced with L-Arabinose.2.2 標(biāo)記菌株的熒光信號(hào)檢測(cè)取誘導(dǎo)后的標(biāo)記菌株和野生菌株菌液制備細(xì)菌抹片，熒光顯微鏡觀察細(xì)菌形光情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株在熒光視野下可發(fā)出明顯的綠色熒光，在明視野下菌形態(tài) (圖 2-3，B1、B2)；而野生菌株未發(fā)出綠色熒光，僅在明視野下有相同菌體 (圖 2-3，A1、A2)。進(jìn)一步分別將誘導(dǎo)后的標(biāo)記菌株和野生菌株菌液過(guò)濾、洗滌后，置于流式細(xì)測(cè)。結(jié)果如圖2-4所示，將標(biāo)記菌株和野生菌株的熒光強(qiáng)度峰值擬合，可發(fā)現(xiàn)明顯右移。說(shuō)明誘導(dǎo)后的標(biāo)記菌株的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于野生菌株陰性對(duì)照綜合以上鑒定試驗(yàn)結(jié)果，可以確定EGFP標(biāo)記的擬態(tài)弧菌構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3433837