血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）是一種具有運載氧、阿片肽、免疫調節(jié)、抗菌和鎮(zhèn)痛等功能的蛋白。本課題研究表明Hb片段（hemocidins）是機體在先天性免疫中殺死外源微生物的重要因子。單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus，Uu）隸屬于螠蟲動物門，是具有重要經濟價值的無脊椎動物。其長期生活在海邊潮間帶泥性底質中，為濾食性動物，直接暴露于各種病原菌及寄生蟲等，但其非特異性免疫系統(tǒng)成功地抵御外來入侵，其中Hb可能起重要作用，而目前對Uu Hb的研究沒有相關報道。本課題根據Uu同屬物種美洲刺螠（Urechis caupo，Uc）Hb F-I完整的cDNA序列（GI:945055），通過3’RACE和5’RACE克隆了Uu Hb F-I的全長cDNA，共780bp。開放閱讀框含429bp，翻譯為含142個氨基酸殘基的成熟肽，命名為UuHb-F-I。預測分子量為15120.67Da，等電點為9.02，其二級結構中含大量α螺旋。為獲得UuHb-F-I，構建原核表達系統(tǒng)BL21（DE3）/pET-22b-UuHb-F-I，經IPTG和乳糖誘導表達成功，其中乳糖誘導在37℃、180r/m... 

【文章來源】：華僑大學福建省

【文章頁數】：108 頁

【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 單環(huán)刺螠的研究進展
        1.1.1 單環(huán)刺螠的簡介
        1.1.2 單環(huán)刺螠的生物學研究
    1.2 血紅蛋白抗菌的研究進展
        1.2.1 血紅蛋白抗菌性的發(fā)現
        1.2.2 Hemocidins 在體外抗菌的研究進展
        1.2.3 Hemocidins 在體內抗菌的研究進展
        1.2.4 Hemocidins 的抗菌機制
        1.2.5 展望與應用
    1.3 美洲刺螠血紅蛋白 F‐I 的研究概況
        1.3.1 美洲刺螠血紅蛋白的特點
        1.3.2 美洲刺螠血紅蛋白 F-I 全長 cDNA 序列
        1.3.3 美洲刺螠血紅蛋白 F-I 成熟肽序列
    1.4 研究目的與意義
    1.5 研究方法
        1.5.1 3’RACE 介紹
        1.5.2 5’RACE 介紹
        1.5.3 原核表達系統(tǒng)
        1.5.4 重組蛋白親和層析
        1.5.5 論文結構安排
第2章 單環(huán)刺螠血紅蛋白 F-I 全長 cDNA 序列的克隆
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗試劑與耗材
        2.1.2 主要實驗儀器
        2.1.3 主要試劑的配制
    2.2 單環(huán)刺螠血紅蛋白 F‐I 部分 cDNA 序列的克隆
        2.2.1 引物設計
        2.2.2 單環(huán)刺螠總 RNA 的提取
        2.2.3 反轉錄 PCR
        2.2.4 感受態(tài)細胞的制備
        2.2.5 純化 PCR 產物
        2.2.6 構建 T 克隆載體
        2.2.7 T-A 克隆菌落 PCR 驗證
        2.2.8 小提質粒 pUM-TA
        2.2.9 雙酶切驗證及測序
    2.3 3’RACE
        2.3.1 引物設計
        2.3.2 反轉錄反應
        2.3.3 套式 PCR 反應
        2.3.4 構建 T 克隆載體及驗證測序
    2.4 5’RACE
        2.4.1 引物設計
        2.4.2 去磷酸化反應
        2.4.3 “去帽子”反應
        2.4.4 5’RACE Adaptor 的連接
        2.4.5 反轉錄反應
        2.4.6 Outer PCR 反應
        2.4.7 Inner PCR 反應
        2.4.8 PCR 產物直接測序
    2.5 生物信息學分析
    2.6 結果和分析
        2.6.1 部分 cDNA 序列的克隆
        2.6.2 3’RACE
        2.6.3 5’RACE
        2.6.4 生物信息學分析
    2.7 小結
    2.8 討論
第3章 UuHb-F-I 成熟肽的原核表達、純化及復性
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗試劑與耗材
        3.1.2 主要實驗儀器
        3.1.3 試劑配制
    3.2 成熟肽原核表達載體的構建
        3.2.1 引物設計
        3.2.2 UuHb-F-I 成熟肽基因的擴增
        3.2.3 DNA 雙酶切
        3.2.4 表達載體 pET-22b-UuHb-F-I 的構建
        3.2.5 重組質粒的鑒定及測序
    3.3 重組蛋白的表達及鑒定
        3.3.1 IPTG 誘導表達
        3.3.2 SDS-PAGE 電泳
        3.3.3 優(yōu)化 IPTG 誘導條件
        3.3.4 乳糖誘導表達
        3.3.5 優(yōu)化乳糖誘導表達條件
        3.3.6 Western Blot
    3.4 重組蛋白的純化及復性
        3.4.1 重組蛋白親和層析
        3.4.2 重組蛋白的復性
    3.5 結果和分析
        3.5.1 PCR 擴增成熟肽序列
        3.5.2 雙酶切 DNA 樣品
        3.5.3 重組菌的菌落 PCR 驗證
        3.5.4 雙酶切驗證
        3.5.5 表達質粒測序
        3.5.6 IPTG 誘導重組表達菌
        3.5.7 乳糖誘導表達重組表達菌
        3.5.8 Western Blot
        3.5.9 重組蛋白親和層析
    3.6 小結
    3.7 討論
第4章 重組蛋白的抗菌活性試驗
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗試劑與耗材
        4.1.2 主要實驗儀器
        4.1.3 試劑配制
    4.2 蛋白濃度測定
    4.3 平板法測活菌數
    4.4 抗菌活性試驗
    4.5 結果和分析
        4.5.4 蛋白濃度測定
        4.5.5 抗菌試驗
    4.6 小結
    4.7 討論
第5章 結論
參考文獻
致謝
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果



本文編號：3433590