副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是一種人獸共患的致病菌,不僅會(huì)導(dǎo)致海洋動(dòng)物的弧菌病,還能引起人類患敗血癥、腸胃炎和傷口感染。嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用是機(jī)體天然免疫中對(duì)抗感染和損傷的一個(gè)重要防御機(jī)制。由于斑馬魚(yú)在受精后的前三周只存在先天免疫,使它具有哺乳動(dòng)物等其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒痪邆涞膬?yōu)勢(shì),目前斑馬魚(yú)已廣泛的應(yīng)用于宿主和病原體相互作用的研究中,尤其在天然免疫應(yīng)答研究中具有突出優(yōu)勢(shì)。為了探究副溶血弧菌和斑馬魚(yú)嗜中性粒細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)變化,以及Notch分子參與天然免疫應(yīng)答的作用,本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)三親本雜交的方法將帶有紅色熒光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Vp57中,獲得了熒光標(biāo)記的細(xì)菌,命名為Vp57^RFP。檢測(cè)了RFP標(biāo)記的質(zhì)粒在Vp57中的穩(wěn)定性和Vp57在標(biāo)記前后生長(zhǎng)曲線及毒力的差異,為后續(xù)示蹤Vp57^RFP感染嗜中性粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供了寶貴的材料。之后,觀察了Vp57^RFP在斑馬魚(yú)體內(nèi)與嗜中性粒細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)變化,建立了人工感染3dpf（days post... 

【文章來(lái)源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1. 副溶血弧菌
        1.1 副溶血弧菌的毒力
        1.2 副溶血弧菌的危害
    2. 常見(jiàn)的原核生物基因重組方法
        2.1 化學(xué)法
        2.2 電擊轉(zhuǎn)化法
        2.3 三親本雜交
    3. 先天免疫
        3.1 斑馬魚(yú)嗜中性粒細(xì)胞在先天免疫中的作用
        3.2 先天免疫分子
    4. Notch分子在免疫中的作用
        4.1 Notch信號(hào)通路的概述
        4.2 Notch信號(hào)對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控作用
    5. 報(bào)告基因
    6. 本研究的目的和意義
第二章 利用三親本雜交標(biāo)記副溶血弧菌Vp57
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)菌株
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 復(fù)蘇Vp57及S17-1λpir
        2.2 pVSV209質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.3 三親本雜交
        2.4 熒光正置顯微鏡觀察
        2.5 PCR鑒定
        2.6 16SrRNA測(cè)序
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 熒光顯微鏡觀察
        3.2 PCR結(jié)果
        3.3 16SrRNA測(cè)序
    4. 討論
第三章 副溶血弧菌Vp57在標(biāo)記前后生理特性的比較
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 菌液準(zhǔn)備
        2.2 Vp57和Vp57~(RFP)生長(zhǎng)曲線的繪制
        2.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)
        2.4 Vp57與Vp57~(RFP)的毒力測(cè)定
        2.5 斑馬魚(yú)感染后的臨床癥狀及細(xì)菌分離
        2.6 病理切片
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 Vp57與Vp57~(RFP)的生長(zhǎng)曲線
        3.2 質(zhì)粒pVSV209的穩(wěn)定性
        3.3 Vp57與Vp57~(RFP)的毒力
        3.4 臨床癥狀及細(xì)菌分離
        3.5 病理切片
    4.討論
第四章 Vp57~(RFP)和斑馬魚(yú)嗜中性粒細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化研究
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 嗜中性粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.2 菌液準(zhǔn)備
        2.3 顯微注射
        2.4 熒光正置顯微鏡觀察
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 嗜中性粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        3.2 Vp57~(RFP)的感染路徑及其與嗜中性粒細(xì)胞的相互作用
        3.3 細(xì)菌對(duì)斑馬魚(yú)致死現(xiàn)象的觀察與統(tǒng)計(jì)
    4. 討論
第五章 Notch1a參與Vp引起的嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)基因的應(yīng)答變化
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 菌液準(zhǔn)備
        2.2 顯微注射
        2.3 斑馬魚(yú)卵及幼魚(yú)的浸泡感染
        2.4 Trizol法提胚胎總RNA
        2.5 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
        2.6 熒光定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)細(xì)胞因子及補(bǔ)體基因的變化
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4. 討論
第六章 斑馬魚(yú)細(xì)胞因子啟動(dòng)子的構(gòu)建和報(bào)告基因載體的活性分析
    1. 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)
        1.2 試劑
        1.3 主要儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 斑馬魚(yú)細(xì)胞因子啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析
        2.2 斑馬魚(yú)基因組提取及細(xì)胞因子啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增
        2.3 報(bào)告基因pGL3-Enhancer載體的構(gòu)建
        2.4 報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光素酶表達(dá)活性測(cè)定
    3. 結(jié)果與分析
        3.1 tnfb、il11b和il13啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析
        3.2 tnfb、il11b和il13啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增
        3.3 tnfb、il11b和il13報(bào)告基因載體的構(gòu)建
        3.4 細(xì)胞因子報(bào)告基因在Raw264.7細(xì)胞中的表達(dá)
    4. 討論
總結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3381293