肌肉生長發(fā)育及分化有關的基因主要是作為負向調控因子的肌肉生長抑制素基因（myostatin,MSTN）和作為正向調控因子的生肌調節(jié)因子（MRFs）。MSTN基因屬于轉化生長因子β（TGF—β）超家族,其功能是抑制成肌細胞的過度增殖,是肌肉發(fā)育的負調控基因;生肌調節(jié)因子家族主要包括Myf5,MyoD,MyoG和MRF4等4個家族成員,其中MyoD基因是脊椎動物肌肉發(fā)育的主導調控基因之一,對骨骼肌的形成和分化起主要作用,缺失可導致成肌細胞的增殖和分化無法進行。魚類應激會影響肌肉生長,為了解應激影響魚類生長的機理,本文以大鱗副泥鰍為研究對象,分別克隆了大鱗副泥鰍的MSTN基因和MyoD基因的cDNA序列,并對其進行序列分析;運用實時熒光光定量PCR技術分析兩個基因的組織表達特異性;檢測地塞米松應激處理后的肌肉組織中MSTN和MyoD基因表達的劑量和時間效應。主要研究結果如下:（1）大鱗副泥鰍MSTN基因的cDNA序列長度為1229bp（GeneBank序列號:KY676785）,編碼375個氨基酸,預測其蛋白質分子量為42072.23Da,理論等電點pI=6.82,其氨基酸序列中存在9個保守... 

【文章來源】：四川農業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１：?ＭＳＴＮ前體蛋白的結構模式圖（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??－－

含有９個保守的半胱氨酸殘基來形成“半胱氨酸節(jié)點”結構，９個半胱氨酸之間可以??在分子內和分子間形成二硫鍵，從而連接形成二聚體，“半胱氨酸節(jié)點”結構在肌肉生??長抑制素活性功能的形成方面發(fā)揮著重要的作用。ＭＳＴＮ前體蛋白的結構如圖１－１所??示：??Ｐｒｅｐ?ｒｏ－Ｍｙｏｓｔａ?ｔｉｎ?ＲＳＲＲ??ＮＨ２｜Ｓｐ｜?Ｐｒｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｏｍａｉｎ?｜｜?Ｍａｔｕｒｅ?ｄｏｍａｉｎ?ＩＣＯＯＨ??圖１－１：?ＭＳＴＮ前體蛋白的結構模式圖（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＭＳＴＮ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｊｅａｎ－Ｃｈａｒｌｅｓ?Ｇａｂｉｌｌａｒｄ?ｅｔｃ．，?２０１３）??由ＭＳＴＮ基因編碼合成的肌肉生長抑制素前體蛋白是沒有生物活性的，它必須??經(jīng)過兩次蛋白酶水解剪切過程之后冰能形成具有生物活性的成熟ＭＳＴＮ蛋白［％。第??一次蛋白酶水解加工的位點在前肽區(qū)和信號肽之間，在細胞內由ＭＳＴＮ基因編碼形??成的前體蛋白由于信號肽的作用會被轉膜分泌到細胞外，但是在轉膜分泌到細胞外之??前會發(fā)生第一次蛋白酶水解加工而把信號肽剪切掉。被剪切掉信號肽的ＭＳＴＮ前體??蛋白，在細胞外由于前肽區(qū)與成熟肽區(qū)有由４個氨基酸（ＲＳＲＲ）組成的蛋白酶加工??位點存在，會第二次被蛋白酶水解加工。ＭＳＴＮ前體蛋白經(jīng)過兩次蛋白酶水解加工后，??剩下氣基端的前肽（Ｌａｔｅｎｃｙ?ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＬＡＰ）和竣基端由同源二聚體組成的??潛伏態(tài)成熟ＭＳＴＮ蛋白（Ａｃｔｉｖｅ?ｍｙｏｓｔａｔｉｎ?ｄｉｍｅｒ）

３．１總ＲＮＡ質量??本實驗利用寶生物公司的ＲＮＡｉｓｏ?Ｐｌｕｓ結合氯仿等試劑對大鱗副泥鰍肌肉組織進??行總ＲＮＡ提取。圖３－１表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果：能清晰地看見２８Ｓ和１８Ｓ兩??條帶，且２８Ｓ條帶明顯比１８Ｓ條帶亮，而５Ｓ條帶基本看不見，說明本次所提取的總??ＲＮＡ的降解程度很低，完整性較好；利用核酸蛋白分析儀測定所提取的總ＲＮＡ，結??果顯示其ＯＤ２６０／２８０平均值為２．０７，說明總ＲＮＡ的純度較高。總的來說大鱗副泥鰍??肌肉的總ＲＮＡ純度高，完整性好，用來作為克�。停樱裕位蚝停停铮幕驎r的反轉??錄模板具有較好的效果。??■一??＿?１８Ｓ??一??圖３－１大鱗副泥鰍肌肉組織總ＲＮＡ?１．５％瓊脂糖凝膠電泳??Ｆｉｇ．３－１?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｄａｂｒｙａｎｕｓ?ｉｎ?１．５％?ａｇａｒｏｕｓ??３．２大鱗副泥鰍ＭＳＴＮ和ＭｙｏＤ基因的ｃＤＮＡ序列??３．２．１?ＭＳＴＮ基因的ｃＤＮＡ序歹ｌｊ??本實驗通過一對特異性引物ＰｄＭＳＴＮ－Ｆｌ和ＰｄＭＳＴＮ－Ｒｌ結合ＲＴ－ＰＣＲ擴增獲得??了一條７００ｂｐ左右的核苷酸序列，將該序列在ＮＣＢＩ中進行ＢＬＡＳＴ比對后發(fā)現(xiàn)它與??稀有鮑鯽的ＭＳＴＮ基因相似度高達９１％，與斑馬魚的ＭＳＴＮ基因相似度也達到了?８８％，??由此可以確認此序列為大鱗副泥鰍ＭＳＴＮ基因的中間片段。由所獲得的中間片段的??核苷酸序列結合其他幾種鯉形目魚類ＭＳＴＮ基因的Ｙ端和５＇端的保守序列，設計兩??２６??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]黃河裸裂尻魚肌肉生長抑制素基因克隆及表達分析[J]. 晁燕,趙蘭英,李長忠,謝保勝,申志新,王國杰,王振剛,李超,拜彬強,張輝,祁得林.  動物學研究. 2012(05)
[2]黃顙魚MyoD基因的克隆及其表達[J]. 梁宏偉,李忠,鄒桂偉,劉小林.  武漢大學學報(理學版). 2012(04)
[3]草魚兩個肌肉生長抑制素cDNA克隆、表達及過量表達對胚胎發(fā)育的影響[J]. 濮劍威,孫成飛,蔣霞云,鄒曙明.  生物技術通報. 2011(08)
[4]魚類應激生物學研究與應用[J]. 趙建華,楊德國,陳建武,朱永久,李茜,馮憲斌,何勇鳳,吳興兵.  生命科學. 2011(04)
[5]鳡肌肉生長抑制素（MSTN）基因的克隆及其組織特異性表達分析[J]. 郁建鋒,張營,王星果,徐建榮,盧祥云,李建林,顧志良.  水產(chǎn)學報. 2010(10)
[6]奧利亞羅非魚、尼羅羅非魚MyoD1和MyoD2基因特征及差異[J]. 盧中華,俞菊華,李紅霞,李建林,唐永凱,阮瑞霞,楊光.  中國水產(chǎn)科學. 2010(05)
[7]蛋白質磷酸化修飾的研究進展[J]. 姜錚,王芳,何湘,劉大偉,陳宣男,趙紅慶,黃留玉,袁靜.  生物技術通訊. 2009(02)
[8]牙鲆肌肉生長抑制素（MSTN）基因克隆[J]. 徐建勇,陳松林.  水產(chǎn)學報. 2008(04)
[9]眼斑擬石首魚肌肉生長抑制素基因克隆及組織表達分析[J]. 薛良義,李婷,楊巧一,肖章奎.  海洋學報(中文版). 2008(03)
[10]擁擠脅迫對魚類影響研究進展[J]. 于淼.  安徽農業(yè)科學. 2008(03)

博士論文
[1]草魚MyoD基因cDNA克隆和表達研究[D]. 王立新.西北農林科技大學 2005

碩士論文
[1]斑鱖myostatin基因克隆及其表達分析[D]. 孫科軍.湖南農業(yè)大學 2012
[2]草魚肌肉生長抑制素（MSTN）的cDNA克隆及地塞米松對其表達的影響[D]. 黃利.西南大學 2009
[3]豬Smad3、MyoD及GDF-8基因調控網(wǎng)絡的研究[D]. 阮井玲.東北農業(yè)大學 2008
[4]MyoD、MyoG基因的多態(tài)性及其與雞屠宰性狀和肉質性狀的相關性研究[D]. 王瓊.四川農業(yè)大學 2007
[5]MyoD和DGAT1基因對牛胴體性狀影響的分析[D]. 田璐.山西農業(yè)大學 2005



本文編號：3330586