肌肉生長發(fā)育及分化有關(guān)的基因主要是作為負(fù)向調(diào)控因子的肌肉生長抑制素基因（myostatin,MSTN）和作為正向調(diào)控因子的生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）。MSTN基因?qū)儆谵D(zhuǎn)化生長因子β（TGF—β）超家族,其功能是抑制成肌細(xì)胞的過度增殖,是肌肉發(fā)育的負(fù)調(diào)控基因;生肌調(diào)節(jié)因子家族主要包括Myf5,MyoD,MyoG和MRF4等4個家族成員,其中MyoD基因是脊椎動物肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一,對骨骼肌的形成和分化起主要作用,缺失可導(dǎo)致成肌細(xì)胞的增殖和分化無法進(jìn)行。魚類應(yīng)激會影響肌肉生長,為了解應(yīng)激影響魚類生長的機(jī)理,本文以大鱗副泥鰍為研究對象,分別克隆了大鱗副泥鰍的MSTN基因和MyoD基因的cDNA序列,并對其進(jìn)行序列分析;運(yùn)用實時熒光光定量PCR技術(shù)分析兩個基因的組織表達(dá)特異性;檢測地塞米松應(yīng)激處理后的肌肉組織中MSTN和MyoD基因表達(dá)的劑量和時間效應(yīng)。主要研究結(jié)果如下:（1）大鱗副泥鰍MSTN基因的cDNA序列長度為1229bp（GeneBank序列號:KY676785）,編碼375個氨基酸,預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為42072.23Da,理論等電點pI=6.82,其氨基酸序列中存在9個保守... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１：?ＭＳＴＮ前體蛋白的結(jié)構(gòu)模式圖（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??－－

含有９個保守的半胱氨酸殘基來形成“半胱氨酸節(jié)點”結(jié)構(gòu)，９個半胱氨酸之間可以??在分子內(nèi)和分子間形成二硫鍵，從而連接形成二聚體，“半胱氨酸節(jié)點”結(jié)構(gòu)在肌肉生??長抑制素活性功能的形成方面發(fā)揮著重要的作用。ＭＳＴＮ前體蛋白的結(jié)構(gòu)如圖１－１所??示：??Ｐｒｅｐ?ｒｏ－Ｍｙｏｓｔａ?ｔｉｎ?ＲＳＲＲ??ＮＨ２｜Ｓｐ｜?Ｐｒｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｏｍａｉｎ?｜｜?Ｍａｔｕｒｅ?ｄｏｍａｉｎ?ＩＣＯＯＨ??圖１－１：?ＭＳＴＮ前體蛋白的結(jié)構(gòu)模式圖（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＭＳＴＮ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｊｅａｎ－Ｃｈａｒｌｅｓ?Ｇａｂｉｌｌａｒｄ?ｅｔｃ．，?２０１３）??由ＭＳＴＮ基因編碼合成的肌肉生長抑制素前體蛋白是沒有生物活性的，它必須??經(jīng)過兩次蛋白酶水解剪切過程之后冰能形成具有生物活性的成熟ＭＳＴＮ蛋白［％。第??一次蛋白酶水解加工的位點在前肽區(qū)和信號肽之間，在細(xì)胞內(nèi)由ＭＳＴＮ基因編碼形??成的前體蛋白由于信號肽的作用會被轉(zhuǎn)膜分泌到細(xì)胞外，但是在轉(zhuǎn)膜分泌到細(xì)胞外之??前會發(fā)生第一次蛋白酶水解加工而把信號肽剪切掉。被剪切掉信號肽的ＭＳＴＮ前體??蛋白，在細(xì)胞外由于前肽區(qū)與成熟肽區(qū)有由４個氨基酸（ＲＳＲＲ）組成的蛋白酶加工??位點存在，會第二次被蛋白酶水解加工。ＭＳＴＮ前體蛋白經(jīng)過兩次蛋白酶水解加工后，??剩下氣基端的前肽（Ｌａｔｅｎｃｙ?ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＬＡＰ）和竣基端由同源二聚體組成的??潛伏態(tài)成熟ＭＳＴＮ蛋白（Ａｃｔｉｖｅ?ｍｙｏｓｔａｔｉｎ?ｄｉｍｅｒ）

３．１總ＲＮＡ質(zhì)量??本實驗利用寶生物公司的ＲＮＡｉｓｏ?Ｐｌｕｓ結(jié)合氯仿等試劑對大鱗副泥鰍肌肉組織進(jìn)??行總ＲＮＡ提取。圖３－１表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果：能清晰地看見２８Ｓ和１８Ｓ兩??條帶，且２８Ｓ條帶明顯比１８Ｓ條帶亮，而５Ｓ條帶基本看不見，說明本次所提取的總??ＲＮＡ的降解程度很低，完整性較好；利用核酸蛋白分析儀測定所提取的總ＲＮＡ，結(jié)??果顯示其ＯＤ２６０／２８０平均值為２．０７，說明總ＲＮＡ的純度較高�？偟膩碚f大鱗副泥鰍??肌肉的總ＲＮＡ純度高，完整性好，用來作為克�。停樱裕位蚝停停铮幕驎r的反轉(zhuǎn)??錄模板具有較好的效果。??■一??＿?１８Ｓ??一??圖３－１大鱗副泥鰍肌肉組織總ＲＮＡ?１．５％瓊脂糖凝膠電泳??Ｆｉｇ．３－１?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｄａｂｒｙａｎｕｓ?ｉｎ?１．５％?ａｇａｒｏｕｓ??３．２大鱗副泥鰍ＭＳＴＮ和ＭｙｏＤ基因的ｃＤＮＡ序列??３．２．１?ＭＳＴＮ基因的ｃＤＮＡ序歹ｌｊ??本實驗通過一對特異性引物ＰｄＭＳＴＮ－Ｆｌ和ＰｄＭＳＴＮ－Ｒｌ結(jié)合ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增獲得??了一條７００ｂｐ左右的核苷酸序列，將該序列在ＮＣＢＩ中進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對后發(fā)現(xiàn)它與??稀有鮑鯽的ＭＳＴＮ基因相似度高達(dá)９１％，與斑馬魚的ＭＳＴＮ基因相似度也達(dá)到了?８８％，??由此可以確認(rèn)此序列為大鱗副泥鰍ＭＳＴＮ基因的中間片段。由所獲得的中間片段的??核苷酸序列結(jié)合其他幾種鯉形目魚類ＭＳＴＮ基因的Ｙ端和５＇端的保守序列，設(shè)計兩??２６??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]草魚MyoD基因cDNA克隆和表達(dá)研究[D]. 王立新.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005

碩士論文
[1]斑鱖myostatin基因克隆及其表達(dá)分析[D]. 孫科軍.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]草魚肌肉生長抑制素（MSTN）的cDNA克隆及地塞米松對其表達(dá)的影響[D]. 黃利.西南大學(xué) 2009
[3]豬Smad3、MyoD及GDF-8基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究[D]. 阮井玲.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[4]MyoD、MyoG基因的多態(tài)性及其與雞屠宰性狀和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究[D]. 王瓊.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[5]MyoD和DGAT1基因?qū)εｋ伢w性狀影響的分析[D]. 田璐.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號：3330586