本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰源海豚鏈球菌（Streptococcus iniae, S. iniae）廣西分離株DGX07為實(shí)驗(yàn)菌株提取總DNA作為模板,對(duì)CAMP因子基因進(jìn)行PCR（Polymerase Chain Reaction）擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD19-T質(zhì)粒中進(jìn)行測序,并應(yīng)用不同的生物信息學(xué)軟件對(duì)其核酸及氨基酸序列進(jìn)行分析；將含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的cfi基因連接至pMD19-T質(zhì)粒中,酶切回收后將其連接至表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）上,最終轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli,E. coli）原核表達(dá)系統(tǒng)BL21（DE3）大腸桿菌內(nèi)；將陽性表達(dá)菌株進(jìn)行CAMP因子重組誘導(dǎo)表達(dá),并優(yōu)化表達(dá)條件；用重組CAMP因子蛋白免疫新西蘭大白兔,并進(jìn)行Western-blot以檢驗(yàn)該蛋白的免疫原性以及在海豚鏈球菌中的表達(dá)情況；用Western-blot檢驗(yàn)重組CAMP因子對(duì)IgG非特異性的粘附；用CAMP因子抗血清探究其對(duì)海豚鏈球菌對(duì)鯉魚上皮瘤細(xì)胞（Epithelioma papulosum cyprini, EPC）粘附及侵染的抑制水平；用重組CAMP因子與重組金黃色葡萄球菌（S... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 海豚鏈球菌的研究進(jìn)展
        1.1 海豚鏈球菌簡介
        1.2 海豚鏈球菌的全球傳播
        1.3 海豚鏈球菌的宿主
    2. 海豚鏈球菌主要致病因子
        2.1 SiM蛋白
        2.2 C5a肽酶
        2.3 白細(xì)胞介素-8蛋白酶
        2.4 鏈球菌溶血素S
        2.5 免疫結(jié)合蛋白
        2.6 莢膜
        2.7 葡萄糖磷酸變位酶
        2.8 表多糖
        2.9 α-烯醇化酶
    3. CAMP因子概述
        3.1 CAMP因子簡介
        3.2 CAMP因子的溶血特性
        3.3 CAMP因子溶血機(jī)理
        3.4 CAMP因子非特異性結(jié)合免疫球蛋白
        3.5 CAMP因子致病性
第二章 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约耙饬x
第三章 cfi的克隆和生物信息學(xué)分析及其蛋白原核表達(dá)
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 材料與試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2 實(shí)驗(yàn)步驟
        2.1 cfi基因的擴(kuò)增及序列分析
            2.1.1 海豚鏈球菌DNA的提取
            2.1.2 cfi基因引物設(shè)計(jì)
            2.1.3 cfi基因的PCR擴(kuò)增
        2.2 重組cfi基因的T載體克隆構(gòu)建
            2.2.1 pMD19-T-cfi的構(gòu)建、測序及生物信息學(xué)分析
            2.2.2 pMD19-T-cfi轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞
        2.3 cfi基因表達(dá)載體pET-32a(+)的構(gòu)建
            2.3.1 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)的制備
            2.3.2 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-cfi的構(gòu)建
            2.3.3 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-cfi轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞
        2.4 CAMP因子重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.4.1 重組蛋白在宿主菌中的分布
            2.4.2 誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化
        2.5 鎳NTA瓊脂糖凝膠過柱純化重組蛋白
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 海豚鏈球菌cfi基因的擴(kuò)增
        3.2 海豚鏈球菌CAMP因子生物信息學(xué)分析
        3.3 pMD19-T-cfi克隆載體的構(gòu)建
        3.4 pET-32a(+)-cfi表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.5 CAMP因子重組蛋白的表達(dá)與優(yōu)化
        3.6 重組蛋白的純化
    4 分析與討論
        4.1 海豚鏈球菌CAMP因子生物信息學(xué)分析
        4.2 海豚鏈球菌CAMP因子原核表達(dá)
第四章 重組CAMP因子生物學(xué)特性研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2 實(shí)驗(yàn)步驟
        2.1 CAMP因子兔抗血清的制備
        2.2 CAMP因子抗血清特異性檢測
        2.3 CAMP因子非特異性結(jié)合免疫球蛋白檢測
        2.4 鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC)粘附/侵染實(shí)驗(yàn)
            2.4.1 EPC細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
            2.4.2 重組CAMP因子粘附EPC細(xì)胞
            2.4.3 重組CAMP因子入侵EPC細(xì)胞
        2.5 重組CAMP因子促溶血實(shí)驗(yàn)
            2.5.1 金黃色葡萄球菌鞘磷脂酶的原核表達(dá)及純化
            2.5.2 CAMP因子血平板促溶血檢測
            2.5.3 血細(xì)胞懸液的制備
            2.5.4 CAMP因子液體促溶血檢測
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 CAMP因子抗血清瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)
        3.2 CAMP因子免疫原性實(shí)驗(yàn)
        3.3 CAMP因子在海豚鏈球菌中表達(dá)情況的檢驗(yàn)
        3.4 CAMP因子非特異性結(jié)合IgG
        3.5 CAMP因子協(xié)助海豚鏈球菌粘附/入侵EPC細(xì)胞
        3.6 CAMP因子血平板促溶血檢測
        3.7 CAMP因子液體促溶血檢測
    4 分析與討論
        4.1 CAMP因子的免疫原性
        4.2 CAMP因子非特異性結(jié)合IgG
        4.3 CAMP因子協(xié)助海豚鏈球菌粘附/入侵EPC細(xì)胞
        4.4 CAMP因子對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞促溶血作用
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3311429