目的依據(jù)“科赫法則”分離鑒定中華鱉致病菌;探索嗜水氣單胞菌表面抗原的免疫活性;以合適的途徑免疫中華鱉,檢測中華鱉免疫學因子和抗病能力的變化,以期篩選到合適的嗜水氣單胞菌共同保護性抗原。方法（1）通過生理生化鑒定、毒力因子、16S rRNA及動物回歸感染試驗鑒定分離菌;（2）設計并合成4對外膜蛋白特異性引物,構(gòu)建外膜蛋白pET30a原核表達載體,轉(zhuǎn)入BL21中進行原核表達;（3）制備嗜水氣單胞菌的主要外膜蛋白,即4種外膜蛋白,注射免疫中華鱉,免疫28天后,取中華鱉血清檢測抗體效價;免疫28天和免疫35天后,通過人工攻擊試驗檢測免疫保護率。結(jié)果（1）分離鑒定到數(shù)株鱉源嗜水氣單胞菌,分離菌氧化酶陽性,能利用葡萄糖、麥芽糖等多種糖苷類;具有運動性;分離菌可檢測到毒力因子氣溶素和血溶素;（2）成功構(gòu)建4種外膜蛋白的表達菌株,SDS-PAGE檢測條帶顯示表達蛋白大小與預期蛋白大小一致;（3）所有免疫組都激發(fā)了顯著的體液和非特異性免疫應答,在人工攻擊后OmpTS和Omp38起到了有效的免疫保護作用,但OmpF和Aha1未起到有效的免疫保護作用。結(jié)論（1）生理生化鑒定、毒力因子及16S rRNA結(jié)果表... 

【文章來源】：浙江萬里學院浙江省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞
第1章 文獻綜述
    1.1 中華鱉的生物學特征及疾病概況
        1.1.1 中華鱉的生物學特征
        1.1.2 中華鱉疾病的概況
    1.2 嗜水氣單胞菌的分類
    1.3 嗜水氣單胞菌的致病性
        1.3.1 流行性
        1.3.2 毒力因子
    1.4 外膜蛋白及其基因
        1.4.1 OmpA蛋白
        1.4.2 微孔蛋白
        1.4.3 脂蛋白
        1.4.4 外膜蛋白的免疫原性
    1.5 對嗜水氣單胞菌的免疫預防
    1.6 總結(jié)
第2章 鱉源致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及毒力因子檢測
    2.1 材料
        2.1.1 材料來源
        2.1.2 試驗用中華鱉
        2.1.3 工具酶及試劑
        2.1.4 常用緩沖液及試劑配制
        2.1.5 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 細菌的分離
        2.2.2 細菌形態(tài)特征觀察和理化特性檢查
        2.2.3 細菌的分子鑒定
        2.2.4 分離菌對中華鱉的致病力試驗
        2.2.5 部分毒力基因檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 病原菌菌落和形態(tài)觀察
        2.3.2 病原菌生理生化特征
        2.3.3 16S rRNA基因序列同源性分析
        2.3.4 人工試驗結(jié)果
        2.3.5 Aer、hly基因檢測結(jié)果
    2.4 討論
第3章 嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白的克隆及其表達載體的構(gòu)建
    3.1 材料
        3.1.1 菌種及載體
        3.1.2 工具酶及試劑
        3.1.3 常用緩沖液及試劑配制
        3.1.4 主要儀器
    3.2 方法
        3.2.1 引物設計
        3.2.2 目的基因的PCR
        3.2.3 PCR產(chǎn)物純化
        3.2.4 感受態(tài)細胞的制備
        3.2.5 質(zhì)粒提取
        3.2.6 酶切與純化
        3.2.7 連接與轉(zhuǎn)化
        3.2.8 嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白基因在大腸桿菌中表達
        3.2.9 重組蛋白的免疫印跡
        3.2.10 包涵體的純化
        3.2.11 SDS-PAGE電泳
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 外膜蛋白基因的克隆與載體構(gòu)建
        3.3.2 重組外膜蛋白的誘導表達與純化
        3.3.3 重組外膜蛋白的免疫印跡
    3.4 討論
第4章 嗜水氣單胞菌四種外膜蛋白對中華鱉的免疫原性
    4.1 材料
        4.1.1 實驗用中華鱉
        4.1.2 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 取血與攻毒實驗
        4.2.2 ELISA檢測特異性抗體效價
        4.2.3 免疫印跡
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 抗體效價的檢測
        4.3.2 人工攻擊實驗與相對免疫保護率
        4.3.3 免疫后中華鱉血清對重組外膜蛋白的識別
    4.4 討論
第5章 展望
參考文獻
附錄A
附錄B
致謝
攻讀碩士學位期間取得的學術(shù)成果



本文編號：3293919